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新菠萝灰粉蚧Dysmicoccus neobrevipes Beardsley和大洋臀纹粉蚧Planococcus minor(Maskell)属于昆虫纲Insecta,半翅目Hemiptera,蚧总科Coccoidea,粉蚧科Pseudococcidae,是我国进境植物检疫性有害生物。由于二者均存在形态近似种,给口岸检疫带来了困难。前者的形态近似种为同属的菠萝灰粉蚧D.brevipes(Cockerell),后者的形态近似种为同属的柑橘臀纹粉蚧P.citri(Risso)。本文对两种检疫性粉蚧及其形态近似种开展试验,研究形态和分子特征相结合的鉴定技术。研究内容(1)生物学试验:室内饲养新菠萝灰粉蚧与菠萝灰粉蚧、大洋臀纹粉蚧与柑橘臀纹粉蚧,观察比较其生物学特性。(2)形态技术研究:对上述粉蚧实验室种群雌性1龄、2龄、3龄若虫及成虫的形态性状特征进行详细的观察、度量、统计、描述及显微形态图绘制,研究新菠萝灰粉蚧与菠萝灰粉蚧,大洋臀纹粉蚧与柑橘臀纹粉蚧的形态识别鉴定特征。(3)分子技术研究:选择上述粉蚧不同地理种群共110个雌成虫样本材料,基于快速、易于操作的DNA条形码技术,选用4个分子标记(28S,ITS,COI,EF-1α)进行引物筛选、基因扩增及序列分析,确立区分鉴定新菠萝灰粉蚧与菠萝灰粉蚧、大洋臀纹粉蚧与柑橘臀纹粉蚧的分子标记。研究结果(1)生物学差异南瓜饲养新菠萝灰粉蚧与菠萝灰粉蚧,成功建立实验室种群,两种粉蚧均有群集的特性,一个世代所需时间约39天。新菠萝灰粉蚧的繁殖力、初孵若虫的成活率及世代存活率都高于菠萝灰粉蚧。柑橘叶片饲养大洋臀纹粉蚧与柑橘臀纹粉蚧,成功建立实验室种群,两种粉蚧生物学特性相似。(2)形态鉴定特征新菠萝灰粉蚧与菠萝灰粉蚧种间鉴定特征1龄若虫:眼基部直径长、肛环直径长分别与体长的比值范围;后足爪与足长的比值范围;背面筛状孔存在与否;刺孔群与腹脐存在与否;筛状孔类型。2龄若虫:眼基部直径长、口器长、肛环直径长、背孔直径长分别与体长的比值范围;后足爪与足长的比值范围;触角柄节、第1、2鞭节分别与触角长的比值范围;三格腺背腹面数量差异;筛状孔在腹面的分布范围;筛状孔类型。3龄若虫:气门长与宽的比值范围;后足爪冠毛与足长的比值范围;体毛与体长的比值范围;触角第4鞭节与第5鞭节长的比值范围;三格腺背腹面数量差异;筛状孔类型。雌成虫:气门长与宽的比值范围;后足爪冠毛与足长的比值范围;背毛与体长的比值范围;触角第4鞭节与第5鞭节长的比值范围;多格腺在第7与第8腹节数量差异;领状腺在第3、8腹节存在与否;筛状孔类型。大洋臀纹粉蚧与柑橘臀纹粉蚧种间鉴定特征1龄若虫:试验中收集的大洋臀纹粉蚧1龄若虫玻片标本少,无法满足形态特征研究的需要,因此未比较两种粉蚧在该龄期的形态鉴定特征。2龄若虫:气门长与体长的比值范围;三格腺背腹面的数量差异;盘孔及领状腺的分布范围。3龄若虫:触角第1鞭节与触角的比值范围;三格腺背腹面的数量差异;盘孔在背面第6腹节存在与否;领状腺存在与否。雌成虫:三格腺背腹面的数量差异;盘孔在背面胸腹部的数量差异;多格腺及领状腺的分布范围。(3)分子鉴定特征引物:选用引物28S_S3660_F/28S_A335_R,ITS_n44_F/ITS_n55_R,Pco_F/C1-12342_R及EF_scutA_F/EF_rcM52.6_R对四种粉蚧进行PCR扩增,均能获得单一、稳定、清晰的目的条带,且扩增所有测试样品均能成功。测序:对上述粉蚧样品扩增的单一条带进行测序,28S、ITS及COI均成功获得其基因序列。EF-1α基因在新菠萝灰粉蚧、大洋臀纹粉蚧及柑橘臀纹粉蚧中均测序成功,在菠萝灰粉蚧样品中测序失败,因为该基因的PCR产物中存在多个同源拷贝。条形码间隔:种间遗传距离的最小值与种内遗传距离的最大值之差为条形码间隔。新菠萝灰粉蚧与菠萝灰粉蚧在28S、ITS及COI基因区段均存在条形码间隔,其值分别为:2.13%、12.51%及4.50%。大洋臀纹粉蚧与柑橘臀纹粉蚧在28S、ITS及COI基因区段均存在条形码间隔,其值分别为:0.28%、0.54%及1.69%;在EF-1α基因区段,两种粉蚧存在单倍型共早现象,因此不存在条形码间隔。NJ系统发育树:新菠萝灰粉蚧与菠萝灰粉蚧的28S、ITS、COI基因序列矩阵构建的NJ树均显示两种粉蚧以高置信度(89%-100%)各自形成独立分支。大洋臀纹粉蚧与柑橘臀纹粉蚧的ITS、COI基因序列矩阵构建的NJ树均显示两种粉蚧以高置信度(99%-100%)各自形成独立分支。28S、EF-1α基因序列矩阵构建的聚类树支持率低于70%。结论:区分新菠萝灰粉蚧与菠萝灰粉蚧的分子标记为:COI(长度约为750 bp),ITS(长度约为1300 bp)和28S基因区段(长度约为750 bp)。区分大洋臀纹粉蚧与柑橘臀纹粉蚧的分子标记为:COI(长度约为750 bp)和ITS(长度约为1300 bp)。