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食管癌是发生在食管上皮组织的一种恶性消化道肿瘤,是全球最常见的癌症之一,致死率极高,五年生存率不足20%。对于晚期不宜进行手术切除的情况,金属支架置入是非外科姑息治疗中缓解食管梗阻的一种主要手段。但是,传统支架材料缺乏持续的抗肿瘤能力和抗炎能力,容易导致管腔再狭窄。所以,如何实现食管支架持续抑制肿瘤细胞生长,以及炎症引起的成纤维细胞、上皮细胞等过度增殖的发生进程,进而防止再狭窄的问题亟待解决。食管载药支架通过所装载药物的释放进行定位治疗,可以赋予支架一定的抗肿瘤功能。然而,支架表面的药物装载量有限,随着药物的释放,其有效浓度逐渐降低为零,最终导致杀伤肿瘤细胞的功能丧失;逐渐暴露的材料基底不仅不能有效阻抗细胞,反而可能会因支架材料良好的细胞相容性促进肿瘤细胞、成纤维细胞、上皮细胞等的生长,这也是影响支架长期疗效的重要因素。因此,在材料基底与药物之间,构建具有持续阻抗细胞生长功能的过渡层非常必要。临床常用的金属食管支架的主要材质之一是317L不锈钢(317L stainless steel,317L SS),对其进行表面改性需要引入能够与其结合的功能分子。多巴胺几乎能与任何固体材料相结合,通过氧化自聚合反应形成聚多巴胺薄膜并为二次反应提供活性基团。聚乙烯亚胺(Poly-ethylenimine,PEI)是富含氨基基团的一类阳离子多聚物,能够通过迈克尔加成反应与席夫碱反应,共价固定到聚多巴胺表面。PEI能够抑制细胞的生长,5-氟尿嘧啶(5-fluorouraci,5-FU)是一种临床常用的有效抗癌药物,原位释放药物更利于杀伤肿瘤细胞。但是,当前有关PEI与5-FU两种功能分子进行食管支架材料表面改性以防止支架内再狭窄的研究尚未见报道。目的本课题在食管支架材料317L不锈钢表面沉积聚多巴胺(poly-dopamine,PDA),在PDA有机过渡层基础上构建聚乙烯亚胺功能层(PDA/PEI),然后固定临床化疗药物5-FU,联合PEI与5-FU协同构建持续阻抗细胞的功能层(PDA/PEI/5-FU),进行参数的优化,并探讨PDA/PEI/5-FU功能层的体外抗肿瘤与抗炎作用及其相关机制。方法1.PDA/PEI/5-FU功能层的制备、表征与优化在317L不锈钢表面经过多巴胺预处理制备出均匀致密的聚多巴胺过渡层;然后经迈克尔加成反应与席夫碱反应固定富含氨基的PEI,形成PEI阻抗底层(PDA/PEI)。在PDA/PEI功能层表面沉积5-FU,形成PDA/PEI/5-FU功能层。使用原子力显微镜(atomic force microscop,AFM)观察各步骤所得样品表面的微观形貌;选用接触角测定仪、酸性橙法等检测材料表面亲疏水性质、氨基总量等;采用吖啶橙/碘化丙啶(AO/PI)染色法检测食管癌细胞Eca109的存活与凋亡,筛选PEI阻抗细胞的最佳分子量。采用紫外分光光度法测定5-FU的固定量和释放量;采用万能力学测试机测试样品抗压强度;测量样品的重量损失以评估功能层的稳定性。2.PDA/PEI/5-FU功能层的体外抗肿瘤、抗炎功能评价及作用机制以食管癌细胞Eca109、上皮细胞Het-1A、成纤维细胞L929为研究对象,AO/PI染色法检测细胞凋亡,筛选出5-FU杀伤细胞的最佳浓度;以小鼠巨噬细胞RAW264.7为研究对象,利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测细胞增殖能力的变化,AO与细胞核染料4’6-二脒基-2-苯基吲哚(4’6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)组合用于检测细胞粘附,考察功能层是否具有抑制炎症细胞的作用;Transwell小室法检测功能层对细胞迁移的影响。Western Blot法检测细胞粘附因子E-cadherin与NF-κB信号通路相关蛋白的表达。ELISA法检测细胞炎症相关因子的分泌情况,考察功能层是否具有抑制细胞产生炎症因子的作用。结果第一部分食管支架材料表面PEI的固定及其抗肿瘤作用通过氨基定量、AFM和水接触角等定性定量表征,结果表明PDA/PEI功能层能够制备成功;细胞毒性评价结果表明PDA/PEI功能层能有效促进食管癌Eca109细胞凋亡和坏死,而且PDA/PEI的抗肿瘤功能与PEI的分子量呈正相关。第二部分材料表面PEI联合5-FU的抗肿瘤与抗炎作用通过5-FU的定量、AFM和水接触角测定等定性定量检测,结果显示PDA/PEI/5-FU功能层制备成功。通过功能层的降解检测5-FU的释放,结果显示5-FU能够在短期内快速释放,而PDA/PEI功能层具有良好的稳定性。生物力学性能检测结果表明,PDA/PEI/5-FU-1具有与317不锈钢相近的抗压能力。细胞培养结果显示,PDA/PEI/5-FU和PDA/PEI功能层能够有效抑制Eca109、Het-1A,L929和RAW264.7的粘附与存活;PDA/PEI/5-FU释放的5-FU能有效促进Eca109、Het-1A和L929细胞凋亡和坏死,5-FU药物释放完后仍可通过PDA/PEI起到持续的阻抗作用。第三部分PEI联合5-FU的抗肿瘤与抗炎机制与317L SS组相比,PDA/PEI/5-FU组能有效降低细胞迁移能力并促进粘附因子E-caherin的表达;Western Blot检测发现,NF-κB信号通路中p65和Bcl-2蛋白表达水平降低,促凋亡因子Bax、caspase-3表达上调。PDA/PEI/5-FU组抑制促炎因子TNFα和IL-1β的分泌,并促进抑炎因子IL-4和IL-10的分泌。结论:1.PDA/PEI/5-FU能抑制Eca109、Het-1A、L929细胞的粘附、迁移,促进细胞凋亡,进而防止再狭窄;初步分析其可能通过调节NF-κB信号通路的活性发挥对细胞生长的抑制作用。2.PDA/PEI/5-FU能够抑制巨噬细胞的生长及炎症因子的分泌,起到抗炎作用。