研究背景：二聚糖(Biglycan, BGN)是一种属于糖蛋白类的蛋白质,由42kDa的核心蛋白(core protein)和两个硫酸软骨素／硫酸皮肤素(chondroitin sulfate, CS/dermatan sulfate, DS)糖胺聚糖(glycosaminoglycan, GAG)链组成,在皮肤组织结构合成、空间填充和皮肤生理功能中起到重要的作用。虽然许多组织表达丰富的二聚糖,但其生物功能仍然知之甚少。二聚糖核心蛋白的合成起始于内质网(endoplasmic reticulum, ER),并继续转移至高尔基体,通过各种糖基转移酶(glycosyltransferases, GTs)的作用下合成CS/DS-GAG链。二聚糖具有组建细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的作用,靶向敲除二聚糖基因可以观察到异常胶原纤维形态和骨质疏松症样表型。分泌的二聚糖通过其核心蛋白和GAG侧链的共同作用下参与合成ECM,特别是对Ⅰ、 Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ型胶原蛋白和弹力蛋白的装配起到重要的作用。最近研究发现二聚糖与炎症密切相关,在脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)引起的脓毒血症小鼠模型中的二聚糖-敲除老鼠较正常组有更长的生存时间；在巨噬细胞二聚糖通过调节Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)2/4和P2X7受体信号通路,分泌肿瘤坏死因子和成熟的IL-1β促进炎性反应。二聚糖的不足影响炎症反应的信号通路,从而降低炎性细胞因子的表达。因此在病原体识别系统中二聚糖扮演着重要的角色,来控制炎症反应。然而BGN在光老化中的功能及其调节机制尚未研究。因此,深入研究BGN在光老化中的作用有重要的理论指导意义。第一部分研究目的：紫外线调节皮肤成纤维细胞的二聚糖表达及其糖胺聚糖链的合成机制研究。材料和方法：紫外线照射成纤维细胞或以siRNA方法敲除成纤维细胞木糖醇转移酶1(xylosyltransferase-1, XYLT1)的表达后,Western blot方法可检测到小质量BGN形式的条带。进一步以siRNA的方法敲除BGN、chondroitinase ABC(ChABC)的方法消化糖胺聚糖链后,明确了小质量BGN蛋白是单链糖胺聚糖形式的BGN。结果：紫外线照射皮肤成纤维细胞可导致完整形式的BGN (Intact form of BGN protein, I-BGN)和核心蛋白(Core protein form)的表达降低,并可观察到增多的较小质量的蛋白质条带。采用BGN-siRNA可敲除这些较小质量的蛋白质条带,还可以被ChABC消化糖胺聚糖链转变成核心蛋白形式,这些结果表明较小质量的蛋白质条带为缺乏糖基化形式的BGN蛋白。另外,紫外线可降低糖胺聚糖链合成蛋白酶XYLT1和2,其中XYLT1的降低更加显著。进一步以siRNA方法敲除XYLT1,可致缺乏糖基化形式的BGN蛋白(defectively-glycosylated BGN, D-BGN)显著增加,而完整形式的BGN蛋白明显降低,但敲除XYLT2时缺乏糖基化形式的BGN和完整形式的BGN的表达均无明显变化。通过共转染XYLT1/2 siRNA和超标达野生型或突变体形式的BGN腺病毒载体。siRNA方法敲除S42A-BGN组XYLT1蛋白可明显增加核心蛋白,但S47A-BGN没有,表明XYLT1作用于两个糖胺聚糖链连接的丝氨酸位点,而XYLT2只作用于一个糖胺聚糖链连接的丝氨酸位点(BGN-S42位点)。结论：紫外线照射皮肤成纤维细胞会增加单链形式的BGN,主要是与紫外线照射显著降低XYLT1的表达和稳定的XYLT2蛋白活性密切相关。第二部分研究目的：BGN在紫外线引起的炎症应答中的作用机制研究。材料和方法：利用siRNA的方法敲除成纤维细胞中BGN和TLR4的表达后,照射紫外线,采用RT-PCR观察促炎症反应相关细胞因子的表达,并分析紫外线与BGN、TLR-4的相关性。进一步以siRNA方法敲除BGN的表达后利用TLR4特异性配体(Ligand)LPS处理成纤维细胞,明确了BGN与TLR4相互作用机制。结果：紫外线照射成纤维细胞显著增加炎性细胞因子的分泌,而敲除BGN和TLR-4的表达明显抑制紫外线引起的炎症反应。另外,对BGN敲出的成纤维细胞处理TLR-4特异性配体LPS时,引发的炎症反应会显著被抑制。综上我们的结果表明细胞外基质成分BGN作为信号传导因子,参与TLR4信号通路促进炎症反应。结论：细胞外基质成分BGN参与TLR4信号通路,促进紫外线引起的炎症应答反应。