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研究背景： 肠道病毒71型(EV71)属于小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属的成员，是引起儿童手足口病(Hand-foot-and-mouth disease，HFMD)暴发流行的主要病原之一。EV71感染不仅可以引起儿童手足口病，严重者还能引发一系列与神经系统相关的并发症如无菌性脑炎、脑膜脑炎、脑干脑炎、脊髓灰质炎样麻痹、心肌炎和肺水肿等，病死率高。EV71病毒受体的鉴定对于明确病毒感染的宿主范围、组织和细胞嗜性，明确病毒-宿主之间的相互作用和致病机理有着重要的作用。目前EV71受体的研究已经取得突破性的进展，已鉴定出EV71的两个不同受体:SCARB2和PSGL-1。因为PSGL-1主要在白细胞上表达，所以它不可能在非白细胞（比如神经细胞，上皮细胞）上作为受体。此外，用两者的配体或抗体都无法完全阻断 EV71对宿主细胞的感染。这些都提示 EV71受体不只一种，PSGL-1是否为第二受体，与PSGL-l无关的T细胞感染是否由SCARB2介导或是由其它受体介导还未可知。由此推测，应当存在一种或多种未知的EV71受体或受体辅助分子。 研究目的： 筛选和鉴定RD细胞上能与肠道病毒71型（EV71）VP1蛋白结合的受体蛋白，为进一步深入研究EV71病毒受体特性和功能提供实验依据。 研究方法： 1、EV71病毒的快速纯化及鉴定：EV71病毒在恒河猴肾细胞(LLC-MK2)细胞中增殖后，收获的细胞培养物经反复冻融、聚乙二醇6000沉淀、差速离心、氯化铯垫层超速离心的方法纯化病毒。用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫印迹(Western blot)和透射电镜(TEM)的方法对纯化病毒进行鉴定，并测定其感染性滴度及回收率。 2、EV71病毒候选受体的筛选：大量培养RD细胞后提取膜蛋白，双向凝胶电泳分离RD细胞膜蛋白后，通过Far-western印迹实验筛选能与EV71病毒VP1蛋白相互作用的RD细胞膜蛋白，同时设立阴性对照，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对特异性结合的蛋白点进行鉴定。 3、病毒候选受体的初步鉴定：采用免疫共沉淀试验来验证SLP-2蛋白与EV71病毒之间的相互作用。 研究结果： 1、病毒纯化后经SDS-PAGE检测后显示出三条带，相对分子量分别为34KD、30KD、26KD与EV71的VP1、VP2和VP3蛋白相符合。Western blot证实34KD的条带为EV71的VP1蛋白。经磷钨酸负染后电镜观察，能看到典型病毒颗粒。终浓度为10％的聚乙二醇6000沉淀后的病毒的感染性回收率为82%，再经氯化铯垫层超速离心后浓缩病毒的感染性回性率为29.0%。 2、通过Far-western印迹检测，从RD细胞上筛选到4个能与EV71结合的蛋白点。质谱分析仅鉴定出一个膜蛋白，即stomatin-like protein2(SLP-2)。免疫共沉淀试验显示SLP-2蛋白能与EV71发生特异性的结合。 研究结论： 1、聚乙二醇6000沉淀与氯化铯垫层超速离心相结合的方法比氯化铯密度梯度区带离心方法更简便易于操作，且比单独聚乙二醇6000沉淀有更高的纯度，是一种简便、有效的病毒纯化方法。 2、至少有4个蛋白可以与EV71的VP1蛋白相互作用，其中RD细胞膜上的SLP-2蛋白能够与EV71病毒的VP1特异性的结合，可能是EV71病毒候选受体或受体辅助分子之一，其在EV71病毒感染RD细胞过程中的作用有待进一步研究。