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目的:检测缺氧诱导下的关节软骨细胞活力和凋亡细胞的比例;在缺氧环境和正常氧含量环境中活性caspase 3的变化、超氧化物产生量、细胞膜渗透性、线粒体超氧化物指示剂含量的变化;研究低氧诱导关节软骨细胞的分子信号通路及CREB相关软骨细胞凋亡机制,检测低氧干扰C28/I2细胞后RhoA的表达变化规律、细胞凋亡程度和CREB磷酸化水平,过表达RhoA后,线粒体功能的变化规律,探索RhoA过表达在软骨细胞缺氧情况下与CREB相关性研究,为探索关节软骨退变的机制奠定基础,为关节退变及免疫性炎性损伤及防治提供基础依据。方法:常规培养人类关节软骨细胞C28/I2,将实验分为两组,缺氧组采用5%CO2和3%氧在培养箱中培养,正常氧组采用常规环境培养,利用MTT实验连续观察培养12小时、24小时和48小时后两组细胞活力的变化,再利用流式细胞技术连续观察24小时和48小时后两组凋亡的比率,Caspase-3的含量采用Caspase SenSolyte试剂盒利用荧光免疫仪在波长为460 nm检测;利用cytochrome c(Cyt c)、caspase 3(CASP 3)、CREB及磷酸化CREB免疫印迹法试剂盒对两组cytochrome c(Cyt c)、caspase 3(CASP 3)、CREB及磷酸化CREB蛋白的表达进行检测,全部实验均独立完成三次,结果采用均数±标准误表示,显著性水平设定为0.05。分别用MitoSOXTM Red线粒体超氧化物指示剂检测线粒体超氧化物,利用ROS-敏感荧光磷酸5-(and-6)-chloromethyl-2,7-dichlorodi-hydrofluorescein试剂盒检测细胞内超氧化物的水平,通过荧光分光光度计在激发光为488nm,散发光为530nm条件下检测,其结果用与对照组比值百分数表示。细胞线粒体膜电位的检测主要采用TMRE-细胞膜膜电位试剂盒进行检测,线粒体呼吸链酶复合物Ⅳ含量通过Rodent酶联活性微盘试剂盒进行检测,通过荧光分光光度计在激发光为575nm,散发光为549nm条件下检测。利用质粒转染技术使C28/I2细胞过表达RhoA,将RhoA基因编码序列克隆到pcDNA3.1(+)质粒载体上,然后将RhoA-pcDNA3.1(+)和对照pcDNA3.1(+)质粒转染C28/I2细胞,两组转染24小时和48小时之后利用免疫印迹法检测RhoA、CREB、磷酸化CREB水平的变化;然后将RhoA-pcDNA3.1(+)关节软骨细胞组在低氧环境中培养24小时和48小时后,分别用MitoSOXTM Red线粒体超氧化物指示剂检测线粒体超氧化物,利用ROS-敏感荧光磷酸化5-(and-6)-chloromethyl-2,7-dichlorodi-hydrofluorescein试剂盒检测细胞内超氧化物的水平,通过荧光分光光度计在激发光为488nm,散发光为530nm条件下检测,其结果用与对照组比值百分数表示。细胞线粒体膜电位的检测主要采用TMRE-细胞膜膜电位试剂盒进行检测,线粒体呼吸链酶复合物Ⅳ含量通过Rodent酶联活性微盘试剂盒进行检测,通过荧光分光光度计在激发光为575nm,散发光为549nm条件下检测。结果:1.MTT实验显示,缺氧环境培养C28/I2细胞24和48小时后,细胞活性显著性下降(p<0.05 or p<0.01)。2.利用流式细胞仪检测发现,缺氧环境下C28/I2细胞凋亡水平显著高于正常氧环境(p<0.01 or p<0.001)。3.利用免疫荧光检测凋亡蛋白caspase 3发现,缺氧环境下培养12、24和48小时后,C28/I2细胞caspase 3水平显著高于正常氧环境(p<0.01 or p<0.001)。4.免疫印迹反应结果显示,细胞色素C和Clv-CASP 3在C28/I2细胞缺氧环境下培养12、24和48小时后,其表达均显著性上调,与正常氧环境相比较,差异有统计学意义;与正常氧浓度下培养相比较,C28/I2细胞缺氧环境下培养,磷酸化CREB显著性下降,而非磷酸化CREB在缺氧环境下无显著性变化。5.缺氧环境下培养关节软骨细胞24小时及48小时后,超氧化物显著性升高,经比较差异具有统计学意义(p<0.01 or p<0.001);ROS产物显著性升高(p<0.05,p<0.01 or p<0.001);MMP显著下降(p<0.05 for 24H.P.T.或者p<0.01 for 48 H.P.T.),线粒体呼吸链酶复合物Ⅳ显著下降,经比较差异具有统计学意义。6.RhoA-pcDNA3.1(+)质粒转染关节软骨细胞24小时和48小时后,RhoA显著性上调(均为p<0.001),经比较,差异具有统计学意义,而磷酸化CREB水平显著性上调(均为p<0.01,干扰24小时与48小时之间),RhoA-pcDNA3.1(+)质粒转染关节软骨细胞后,可以显著性缓解低氧诱导的细胞活力降低(p<0.05,24或48小时),与对照组比较,RhoA过表达关节软骨细胞组中,低氧诱导的caspase 3的活力被抑制。与转染pcDNA3.1(+)质粒对照组比较,转染RhoA-pcDNA3.1(+)关节软骨细胞组在低氧环境中培养后,线粒体超氧化物产物显著性降低(p<0.05,转染24小时,p<0.01转染48小时后),与转染pcDNA3.1(+)质粒对照组比较,转染RhoA-pcDNA3.1(+)关节软骨细胞组在低氧环境中培养后,ROS显著性降低(p<0.05,转染24小时,p<0.01转染48小时后),转染RhoA-pcDNA3.1(+)关节软骨细胞组在低氧环境中培养后,RhoA的过表达显著性促进MMP和线粒体呼吸链酶复合物Ⅳ的分泌。结论:1.缺氧诱导C28/I2细胞活性显著性下降,凋亡水平显著上升,caspase 3水平,细胞细胞色素C和Clv-CASP 3显著性上调,磷酸化CREB显著性下降,而对非磷酸化CREB无影响。2.缺氧环境下培养关节软骨细胞,超氧化物ROS产物显著性升高,MMP、线粒体呼吸链酶复合物Ⅳ显著下降,具有抑制线粒体功能的作用。3.RhoA-pcDNA3.1(+)质粒转染关节软骨细胞后,RhoA、磷酸化CREB水平显著性上调,可以显著性缓解低氧诱导的细胞活力降低降低细胞凋亡水平。4.转染RhoA-pcDNA3.1(+)关节软骨细胞组在低氧环境中培养后,线粒体超氧化物、ROS产物显著性降低,促进了MMP和线粒体呼吸链酶复合物Ⅳ的分泌。