番茄红素是一类具有巨大商业价值的类胡萝卜素天然产物,在食品、医药等领域具有广泛应用。目前,通过微生物细胞工厂生产这一化学品,已成为实现番茄红素绿色制造的重要研究方向。传统的代谢工程策略偏重于相对简单的异源途径整合和竞争途径敲除,然而,由于代谢网络存在复杂的相互作用,依据这类策略所构建工程菌株的产量和理论生产得率相差甚远。这说明需要从全基因组的水平重构微生物的代谢网络。具体而言,我们需要在全基因组范围内发掘宿主菌中与番茄红素途径具有相互作用的基因位点,通过这些位点的编辑重构微生物的代谢网络,实现更高的产量。近年来一些研究表明,一些酶具有底物非特异性,也就是说一种酶能对多种不同底物具有催化活性,其中具有代表性的是磷酸水解酶系。具有底物广谱性的磷酸水解酶可能对番茄红素合成途径中的中间产物具有催化活性。因此,本研究提出假设:具有底物广谱性的内源磷酸水解酶能够非特异性地催化大肠杆菌内番茄红素合成途径中的磷酸化合物水解,降低途径碳流,从而减少目标产物产量。故本文研究基本策略为通过抑制基因组上这类磷酸水解酶基因的表达从而增加途径碳流,提高目标产物产量。本实验以大肠杆菌DH1为宿主菌,在已有生产番茄红素初始菌株的基础上,首先,在初始菌基因组smf位点上增加合成番茄红素途径中的关键基因crt EIB拷贝数,表征结果表明,相较于初始菌,番茄红素产量有了34%的提高,并将此菌命名为lyc011。其次,在大肠杆菌MEP途径中具有一系列磷酸化中间代谢产物,而具有底物广谱性的磷酸水解酶可能对这些中间产物具有催化活性。通过直接预测和系统生物学的方法,对DH1基因组中可能对番茄红素合成途径中间代谢产物具有催化活性的磷酸水解酶进行分析、预测。最终得到57个磷酸水解酶基因。我们计划利用CRISPR干扰(CRISPR interference,CRISPRi)原理对于这些基因对番茄红素生产的影响进行筛选。为此,首先我们成功构建了57个含双single guide RNA(sg RNA)的质粒,靶向上述的57个基因。将pd Cas9质粒和sg RNA表达质粒导入到初始菌lyc011中,最终通过发酵表征成功筛选到了15个对番茄红素产量提高具有正向作用的磷酸水解酶基因分别为:yjj G,aph A,nag D,yqa B,yid A,pph A,bac A,glp Q,pgp B,spo T,cpd B,nud J,dgt,pho Q。以大肠杆菌内源的磷酸水解酶系作为案例研究,可以帮助我们更深入的理解酶的底物非特异性对于代谢系统,特别是整合的异源途径的影响。通过解除异源途径和内源代谢的相互作用,该方法具有在今后代谢工程研究中作为一种一般性策略的潜力。