骨质疏松（osteoporosis）是由于骨强度降低引起的骨折风险增加的慢性复杂代谢性疾病。随着社会老年化，骨质疏松已成为严重威胁我国人口健康的高发疾病。其主要危害是骨折风险增加。男性骨质疏松骨折发病率低于女性，但死亡率却明显高于女性，其发生机制尚不清楚。既往研究主要集中在女性绝经后骨质疏松，由于不同性别间骨质疏松的环境及遗传影响因素存在差异，非常有必要对男性骨质疏松相关表型进行研究。骨强度降低是骨质疏松发生的关键病理生理改变。骨强度反映骨的密度和骨质量。骨密度（bone mineral density, BMD）可反映约70%的骨强度情况，并且是目前骨质疏松诊断的金标准，所以骨密度也是最常使用的骨强度变量。髋部几何形态（hipgeometry）独立于BMD能反映骨强度。在男性和女性中都发现股骨颈剖面形态参数是独立的髋部骨折风险危险因子。骨面积与骨质疏松骨折发生率显著相关，有流行病学研究发现股骨颈骨面积是独立的髋部骨折风险因素。定量超声（Quantitativeultrasound，QUS）可无创检测骨结构及材料性状变化，可反映骨质量的变化，因此也可被认为是骨强度参数之一。上述骨强度参数均受到环境和遗传的协同调控。在峰值骨密度达到阶段，年龄及环境因素对BMD的累积影响效应相对较低，人群中的变异主要受遗传因素影响。研究峰值骨密度年龄段人群的骨强度遗传变异度有助于排除非遗传因素的影响，可能更易发现相关基因。随着人类基因组计划的完成、生物信息学、统计学等学科的发展，通过候选基因法（candidate gene approaches）、连锁分析（linkage analysis）和全基因组关联分析（genome-wide association study, GWAS)技术的应用，骨强度相关的许多候选基因得到了鉴定和明确。但这些研究在不同人群/人种中的结果存在差异或矛盾之处。这提示我们有必要在中国人群中研究/验证骨强度相关基因。既往研究提示参与调节骨骼的发育和成年期骨代谢的基因可能也是骨质疏松/骨强度表型的相关基因。成纤维生长因子受体（fibroblast growth factor receptors，FGFRs）1、2、3型在骨骼细胞表达并参与调节其生长发育和成年期骨代谢。多种FGFRs基因突变可导致人类骨骼遗传病，出现头颅、脊柱、胸廓、四肢长骨畸形。既往在欧美人群中发现FGFR1和FGFR2的基因多态性与BMD相关。这些研究集中在白人老年人群中，并且只检测了骨强度的一个变量，考虑到骨强度变量间遗传差异度、不同人种的遗传异质性、欧美与中国BMD环境影响因素的不同等，有必要在中国青年人群中检测FGFRs是否是BMD及其它骨强度变量的相关基因。我们既往发现这三种FGFRs可通过调节骨骼细胞生物学活性影响骨生物力学性能与骨密度。FGFRs也可通过调节磷代谢来影响骨密度。骨细胞合成的FGF23可在肾小管上皮细胞中特异性结合FGFR1、3、4并与Klotho形成复合物来抑制肾脏磷重吸收，调节血磷平衡，间接影响骨骼的矿化。FGF23也可依赖于维生素D受体（vitaminD receptor, VDR）调节肠道磷的吸收。但FGFRs是否参与肠道磷吸收尚不清楚。为此，本研究将首先在中国青年人群中检测FGFRs是否是BMD及其他骨强度变量的相关基因。另外利用动物模型探讨FGFR1在肠磷吸收中的作用及可能的机制，并检测其对骨强度的影响。主要实验方法：1.中国青年汉族男性骨强度环境影响因素及其与FGFRs SNPs相关性分析1.1研究对象人群资料采集共计812名某陆军汉族新兵被纳入本研究，测量身高（m）、体重（kg）、腰围（cm）、臀围（cm），同时计算BMI。问卷表记录出生日期、籍贯、既往生活习惯、家庭成员骨骼健康情况。1.2骨强度各变量测量采用Prodigy DXA测量第1到第4腰椎（L1-4）与左侧股骨颈（Femoral Neck, FN）、全髋（Total hip, TH）的BMD（g/cm2）、骨面积值（cm2）。左侧髋部形态参数由HSA软件（Prodigy，GE）基于骨密度检测结果进行自动分析获取：包括髋轴长度(hip axislength, HAL)(mm)、股骨颈角度(neck–shaft angle, Angle)(o)、骨骼强度系数(femoralstrength index, SI)、横截面积(cross-sectional area, CSA)(mm2)及横断面转动惯量(cross-sectional moment of inertia, CSMI)(mm4)。SONOST2000跟骨定量超声仪测量QUS参数，包括超声速率（Speed of sound, SOS）（m/s）、宽带超声衰减（Broadbandultrasound attenuation, BUA）（Db/MHz），并计算刚度系数（QUS-SI）。1.3ELISA法检测血清骨代谢指标（Tracp5b、BALP）。1.4基因组DNA提取后利用iMLDR法对FGFRs基因型进行检测。1.5统计分析采用SPSS11.0软件进行统计。计量资料以均数±标准差(x±SD)表示。Bartlett检验各计量资料方差是否齐性，Shapiro-Wilks检验检测各计量资料是否符合正态分布。卡方检验计算各SNP位点分布是否符合Hardy-Weinberg定律。PS v3.0.43软件计算检验效能。Haploview4.2计算LD及连锁不平衡系数r2。Stepwise回归分析各骨强度变量的协变量，年龄、身高、体重、腰围、臀围、BMI等为候选变量。ANOVA法分析各SNP位点基因型间年龄、身高、体重、腰围、臀围、BMI的差异。ANCOVA法分析各SNP位点基因型与各骨强度变量的相关性，分析各单体型与BMD的相关性。P<0.05表示差异显著。2. FGFR1对肠道发育和钙磷吸收的影响2.1FGFR1-vil条件性敲除小鼠繁殖及鉴定。2.2测量小鼠出生后体重、肠道长度、周径、肠绒毛高度、隐窝深度的变化。2.3AB-PAS染色计数杯状细胞和潘氏细胞。ALP染色检测肠细胞分化情况。BrdU检测细胞增生变化。TUNEL法检测肠绒毛上皮细胞凋亡变化。2.4免疫组化或免疫荧光检测肠绒毛上皮细胞FGFR1、NPT2b、P-ERK、P-JNK表达。2.5臧红固绿染色、TRAP染色检测小鼠骨骼病理形态及破骨细胞活性变化。micro-CT分析小鼠股骨近端松质骨和中段皮质骨变化。2.6检测不同磷含量饮食条件下小鼠粪便、尿液及血清钙磷含量。2.7定量PCR检测钙吸收相关基因（calbindin D9k、TRPV6、VDR）、磷吸收/重吸收相关基因（NPT2a、2b、2c）、FGFR1、IGF1在肠道或肾脏的表达情况。2.8WB检测肠绒毛组织P-P38及不同磷含量饮食条件下NPT2b蛋白含量变化。2.9共转染FGFR1siRNA及NPT2b报告基因质粒，检测其荧光素酶活性变化。2.10采用SPSS11.0软件进行统计。计量资料以均数±标准差(x±SD)表示。独立样本T检验比较组间差异。P<0.05表示差异显著。主要实验结果：1.中国汉族青年男性各骨强度变量的环境影响因素1.1BMD的环境影响因素年龄、体重、BMI、腰围与L1-4、FN及TH的BMD及BMC均显著正相关。三个部位峰值BMD均出现在22岁组。地域对BMD存在显著影响，西南地区组人群L1-4BMD显著低于北方地区组和东南地区组（P<0.05）。种族也是BMD的一个重要影响因素，本研究人群L1-4峰值BMD值均高于韩国及印度人群，髋部峰值BMD略低于印度人群，但仍高于韩国人群。军事训练后三个部位骨密度均显著高于训练前。训练后血清TRACP5b含量显著降低，BALP含量显著增加（P<0.001）。相关分析显示，TRACP5b和BALP与年龄负相关（P<0.001）。训练前后BALP变化率与L1-4BMD和全髋BMD变化率显著正相关（P<0.05）。1.2骨面积、髋部形态及跟骨QUS参数的环境影响因素年龄是影响腰椎骨面积的正性调节因素（P<0.05），但各年龄组间股骨颈及全髋骨面积均无显著差异。经过身体测量参数校正，发现年龄为CSA及CSMI的主要变异变量，21-23岁年龄组的CSA及CSMI显著高于低龄组（17-18岁）（P<0.05）。22及23岁年龄组SI显著高于18岁组（P<0.05）。HAL和Angle变异与年龄变化无关。年龄为三个QUS参数的主要变异变量（P<0.05）。SOS、BUA、QUS-SI的最大均值均出现在23岁年龄组。20-23岁年龄组的SOS、BUA显著高于低龄组（17-19岁）（P<0.05）。2.中国汉族青年男性各骨强度变量与FGFRs SNP相关性2.1BMD与FGFRs SNP相关性位于FGFR2基因exon1区域的rs1047111位点的基因多态性与腰椎（P=0.013）及股骨颈骨密度（P=0.0012）相关。FGFR1基因上rs2956724、rs6983315、rs6474354及rs4733930构成单倍体，但其4种单倍体型与腰椎、股骨颈和全髋BMD均无显著相关性。2.2骨面积与FGFRs SNP相关性位于FGFR1基因intron4的rs2288696(P=0.006)、位于intron3的rs2956724(P=0.028)及rs6474354(P=0.025)位点的基因多态性与股骨颈面积相关（表4-2）。位于FGFR15’-Flanking区域的rs10958704(P=0.043)位点的基因多态性与髋部面积相关。2.3髋部形态与FGFRs SNP相关性FGFR1基因内位于intron4区域的rs2288696基因多态性与髋部CSA和CSMI相关（P=0.049,0.035），单个G等位基因也存在显著效应，GG和GA基因型的CSA及CSMI均显著低于AA基因型。髋部SI与位于5’-Flanking的rs10958704基因多态性相关（P=0.027）。2.4跟骨QUS参数与FGFRs SNP相关性位于FGFR1基因intron2的rs4733946位点与跟骨SOS（P=0.017）及QUS-S（IP=0.025）显著相关，位于intron3的rs2956724与跟骨BUA（P=0.000）及QUS-SI（P=0.026）显著相关，位于5’-Flanking的rs10958704与跟骨SOS（P=0.023）显著相关。3. FGFR1通过MAPK-P38通路正性调节肠腔扩张及细胞凋亡3.1肠绒毛上皮细胞特异性敲除FGFR1降低肠周径定量PCR及免疫组化结果显示FGFR1在肠绒毛敲除效率在70%左右，肠绒毛上皮只检测到少量细胞残存表达FGFR1。FGFR1-vil小鼠（敲除小鼠）的体重及小肠长度无显著改变。FGFR1-vil小鼠回肠周径降低，回肠绒毛高度增加，但隐窝深度无显著差异。FGFR1-vil小鼠回肠IGF1表达降低，且与FGFR1mRNA表达水平正相关。提示FGFR1可能通过影响上皮下层IGF1表达调节肠腔扩张。3.2肠绒毛上皮细胞特异性敲除FGFR1不影响上皮细胞增生、分化但抑制凋亡BrdU掺入在两组间无显著差异，提示肠上皮敲除FGFR1不影响细胞增生。利用AB-PAS染色计数杯状细胞和潘氏细胞未见明显差异。ALP活性从近端小肠到远端小肠逐渐减弱，但两组间无明显差异。提示FGFR1不影响杯状细胞、潘氏细胞和肠细胞的分化。FGFR1-vil小鼠肠绒毛上皮细胞凋亡信号阳性细胞数量减少，提示FGFR1正性调节肠上皮细胞凋亡。3.3肠绒毛上皮细胞特异性敲除FGFR1后P-P38水平降低使用免疫组化检测到FGFR1-vil小鼠肠绒毛上皮细胞P-ERK与WT比较无显著差异，而P-JNK表达减少，但WT小鼠表达量也较低。WB结果发现FGFR1-vil小鼠肠绒毛上皮组织P-P38蛋白量显著减少。这提示FGFR1可能主要通过MAPK-P38通路影响肠道发育。4. FGFR1不依赖于食物磷含量和VDR途径，通过转录前负性调控NPT2b抑制肠道钙磷吸收4.1FGFR1-vil小鼠血磷正常，肠磷吸收增加，尿磷重吸收减少正常饮食（0.9%Pi），FGFR1-vil小鼠血清钙磷与WT小鼠比较无显著差异。利用0.5M NaH2PO4溶液灌胃小鼠制造急性高磷血症，FGFR1-vil小鼠小鼠血磷增加幅度更明显（P<0.05）。长期给予小鼠高磷饲料（1.25%Pi），FGFR1-vil小鼠小鼠血磷增高（P<0.05），而WT小鼠血磷仍维持在正常水平。正常饮食FGFR1-vil小鼠尿磷含量显著增加，同时粪便磷含量显著减少（P<0.05）。尿钙和粪便钙含量也有类似变化趋势。低磷饮食FGFR1-vil小鼠尿钙、尿磷含量增加，同时粪便钙含量降低。这提示FGFR1-vil小鼠肠磷吸收增加，同时尿磷重吸收减少以维持血磷稳定。4.2FGFR1-vil小鼠肠上皮NPT2b表达增加，肾皮质NPT2a表达降低FGFR1-vil小鼠回肠组织NPT2b mRNA表达水平和蛋白含量均增加。低磷饲料增加WT小鼠NPT2b蛋白量，而高磷饮食降低NPT2b蛋白量。FGFR1-vil小鼠NPT2b蛋白表达量对饮食P含量变化有类似反应趋势，但变化幅度较WT小鼠显著降低。转染FGFR1siRNA后CaCO2细胞中人NPT2b启动子活性增加。提示FGFR1不依赖于食物磷含量转录前负性调控NPT2b，FGFR1-vil小鼠肾皮质中，调节磷重吸收的NPT2a mRNA表达水平降低，但NPT2cmRNA表达水平无显著变化。提示肠磷吸收异常时可通过改变NPT2a表达来调节肾磷重吸收。FGFR1-vil小鼠肠上皮组织内钙吸收相关基因钙结合蛋白D9k（calbindin D9k）、VDR和V型瞬时感受器电位阳离子通道6（transient receptor potential cation channel,subfamily V, member6, TRPV6） mRNA表达水平无显著改变。这提示FGFR1不影响VDR介导的肠钙主动吸收。4.3FGFR1-vil小鼠骨骼表型未见异常臧红固绿染色显示FGFR1-vil小鼠同WT小鼠比较，病理形态无明显改变，TRAP染色显示破骨细胞活性也无明显差异。micro-CT分析股骨近端松质骨和中段皮质骨变化，两组小鼠间仍未见显著差异。全文结论：1.中国青年男性BMD受到运动、地域、种族等环境因素的影响，在22岁达到峰值BMD。2.年龄是获得峰值骨密度年龄段中国青年男性骨面积、髋部形态和QUS参数的主要影响因素。3. FGFR1是一个与骨面积、髋部形态和骨质量相关的多效应基因，FGFR2是BMD的相关基因。4.肠绒毛上皮表达的FGFR1通过激活MAPK-P38通路促进肠绒毛上皮细胞凋亡并正性调节肠腔扩张。5.肠绒毛上皮表达的FGFR1通过转录前负性调控NPT2b表达，不依赖食物磷含量和VDR途径抑制肠磷吸收。