灰葡萄孢(Botrytis cinerea)是一种可引起严重植物灰霉病的病原真菌,也是研究植物与微生物相互作用的重要模式生物之一。用遗传学的方法分析研究该真菌关键基因的功能,结合细胞学、生化方法将有利于我们对该病菌致病机制等的了解。本研究利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的T-DNA随机插入技术获得了致病力减弱的转化子ABcsec5,利用PCR扩增选择标记基因潮霉素抗性基因的办法对转化子进行了分子鉴定。利用Southern blot技术分析发现该转化子为T-DNA单拷贝插入。利用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)技术扩增了该转化子的T-DNA插入位点旁侧序列,经过载体克隆成功完成了序列测定,并对序列进行了分析。分析发现,突变体ΔBcsec5中T-DNA插入基因编码一个预测蛋白,GenBank BLAST比对发现该预测蛋白与分泌系统exocyst复合体的一个亚基Sec5相似性较高。利用单孢分离,PCR鉴定实验获得了该突变体的单核转化子。RT-PCR分析表明该基因表达丧失,从而基因表达水平上确认基因功能的插入失活。该突变体表现为生长速率减缓,孢子萌发率降低,菌丝多蜷曲分枝,几丁质含量升高,对番茄叶片的致病能力减弱。转化子在含有CFW,SDS,sorbitol,NaCl,KC1或MgC12的PDA平板上的生长情况并未显示出与野生型有明显的区别。透射电镜观察该突变体,发现部分突变体细胞中出现含高电子密度物质的分泌囊泡。该现象可能与细胞的极性胞外分泌缺陷相关。以上证据表明,灰葡萄孢中SEC5基因参与了灰葡萄孢的生长发育性状的调控并参与了对寄主植物的致病性。克隆了SEC5的全长基因序列,包括启动子、转录区和终止序列,构建双元表达载体并转入农杆菌对该突变体菌株进行该基因遗传互补。并克隆了 SEC5的转录区序列,构建成功了该基因的GFP融合蛋白表达载体,将该载体转化农杆菌后用于蛋白的细胞定位实验。