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实验目的:放射治疗是胸部肿瘤常规治疗方法之一,而放射性肺损伤(radiation induced lung injury,RILI)是放疗的常见不良反应。据文献报道,接受放疗的肺癌患者中,放射性肺损伤的发生率约20%。虽然近几年放疗技术水平大幅进步,但RILI的发生率仍没有下降趋势。临床上放射性肺损伤的治疗药物虽多种多样,但目前仍缺乏效果佳、副作用少的药物。异甘草酸镁为第四代甘草酸制剂,具有抗炎、抗氧化、免疫调节、保护细胞膜等生理活性,临床主要用于慢性病毒性肝炎、急性药物性肝损伤的治疗。近来,研究证明,异甘草酸镁可改善百草枯或博来霉素引起的肺损伤和肺纤维化,但其是否对放射性肺损伤有保护作用,目前尚无报道。因此本研究旨在探讨异甘草酸镁对放射性肺损伤的改善作用并初步探索其作用机制。实验方法:(一)异甘草酸镁对小鼠放射性肺损伤的改善作用1.动物模型的建立:采用60Co源γ射线15Gy单次照射C57BL/6雌性小鼠全胸,分别至照射后4周、8周、12周处死小鼠。2.动物分组和给药:150只C57小鼠随机分为5组:对照组、辐照组、异甘草酸镁组、异甘草酸镁治疗组和地塞米松治疗组,每组30只。各组小鼠于造模前2h及造模后每日腹腔给药:IR+Mg IG组和Mg IG组注射Mg IG(100 mg/kg);IR组和Control组注射生理盐水(20m L/kg);IR+DXM组注射DXM(0.5 mg/kg)。3.检测:1观察小鼠全身情况(活动、精神状态、体重、胸部皮毛);2肺脏大体情况、HE染色和Masson染色观察肺组织病理变化,并对肺泡炎症程度、纤维化程度进行评分;3采用免疫组化法检测小鼠肺组织collagen I、collagen III、α-SMA、fibronectin、TGF-β1、p-smad2、p-smad3、Nox4、p-p38和p-AKT蛋白表达水平;(4)采用实时定量PCR法检测肺组织α-SMA、fibronectin和TGF-β1 m RNA水平;(5)采用ELISA法检测血清TGF-β1含量;(6)采用生化法测定肺组织MDA含量、SOD活力和GSH-PX活力。(二)异甘草酸镁调控p38/AKT/Nox4抑制电离辐射诱导肺成纤维细胞分化1.细胞分化模型的建立:采用60Co源γ射线8Gy单次照射肺成纤维细胞株(HFL-1),给予细胞异甘草酸镁(0.01mg/m L)预处理24h,照射后72h收集细胞。2.检测:1CCK-8法检测辐照后细胞增殖率;2western blot法检测细胞内a-SMA、fibronectin、Nox4、p-p38和p-AKT蛋白表达水平;3免疫荧光法检测细胞内a-SMA、fibronectin蛋白表达水平;(4)流式细胞术法检测细胞内ROS含量。实验结果:(一)异甘草酸镁对小鼠放射性肺损伤的改善作用1.小鼠经15Gy全胸辐射后,逐渐出现精神萎靡,行动减慢,皮毛暗沉,脱毛。造模2周后,动物精神状态和活动慢慢恢复。辐照后8周左右,小鼠胸部出现不同程度白毛。经异甘草酸镁和地塞米松分别治疗后,小鼠的精神状态、活动和胸部毛发变白情况有所缓解。2.辐照后4周,小鼠肺表面呈现出血点,辐照后8、12周双肺表面充血严重,弹性较差。异甘草酸镁和地塞米松分别治疗后,小鼠双肺情况均有所改善。3.辐照后1周,各辐照组小鼠均出现体质量下降。相较于正常对照组,单纯辐照组小鼠体质量下降明显(P<0.05),而相较于单纯辐照组,异甘草酸镁治疗组体质量较高且具有统计学意义(P<0.05),地塞米松治疗组与单纯辐照组小鼠体质量无明显差异。2周以后,各辐照组小鼠体质量逐渐回升。辐照后8周和12周,单纯辐照组小鼠体质量明显小于正常对照组(P<0.05),异甘草酸镁处理组体质量明显大于单纯辐照组(P<0.05),地塞米松处理组明显小于单纯辐照组(P<0.05)。4.辐照后4周,肺组织以炎症变化为主。辐照后8、12周,肺组织以炎症以及纤维化灶形成为主。肺泡炎和纤维化评分:相较于正常对照组,单纯辐照组分数明显增加(P<0.05)。经异甘草酸镁和地塞米松分别治疗后,肺组织炎症和纤维化病变皆有缓解,肺泡炎和纤维化评分较单纯辐照组低(P<0.05)。5.免疫组化结果显示辐照后小鼠肺组织collagen I、collagen III、α-SMA、fibronectin、TGF-β1、p-smad2、p-smad3、Nox4、p-p38和p-AKT蛋白表达水平皆增加,经异甘草酸镁和地塞米松分别治疗后上述蛋白水平皆降低。6.辐照后12周,异甘草酸镁治疗组和单纯辐照组肺组织α-SMA m RNA表达水平存在明显差异(P<0.05),而fibronectin基因表达水平差异不明显(P>0.05)。7.照射后4周、8周和12周,肺组织MDA含量皆升高而SOD、GSH-PX活力皆降低,与正常对照组相较,有明显的统计学差异(P<0.05)。经异甘草酸镁和地塞米松治疗后,各时间点肺组织MDA含量与单纯辐照组相比明显减少(P<0.05),SOD、GSH-PX活力明显升高(P<0.05)。8.照后4周,8周,12周,血清中TGF-β1含量和肺组织TGF-β1 m RNA皆增加(P<0.05与Control组相比),经异甘草酸镁和地塞米松分别治疗后上述指标表达降低,与单纯辐照组有统计学差异(P<0.05)。9.异甘草酸镁治疗组和地塞米松治疗组之间,小鼠体质量,α-SMA m RNA表达以及辐照后8周SOD活力存在统计学差异;肺泡炎、纤维化评分,血清TGF-β1含量,肺组织TGF-β1 m RNA水平皆无明显统计学差异。(二)异甘草酸镁调控p38/AKT/Nox4抑制电离辐射诱导肺成纤维细胞分化1.8Gyγ射线照射对肺成纤维细胞的增殖无明显影响(P>0.05与Control组相比)。0.0001?0.01mg/m L异甘草酸镁处理细胞,其增殖率与正常对照组及单纯辐照组比无明显差异(P>0.05),仅0.1mg/m L异甘草酸镁可明显抑制细胞的生长(P<0.05与Control组及IR组相比)。2.8Gyγ射线照射可显著增加肺成纤维细胞内α-SMA蛋白表达,而异甘草酸镁可明显抑制辐照增加的α-SMA表达,其作用呈剂量依赖性。3.免疫荧光和Western blot结果显示:照射后72h,肺成纤维细胞内α-SMA和fibronectin蛋白表达增加。异甘草酸镁可抑制电离辐射的这一效应。4.流式细胞术检测结果显示:辐照后1h,单纯辐照组细胞内平均荧光强度高于正常对照组(P<0.05)。相较于单纯辐照组,异甘草酸镁治疗组平均荧光强度明显降低(P<0.05)。5.Western blot结果显示:辐照后72h,单纯辐照组相较于正常对照组Nox4蛋白表达水平明显增加(P<0.05)。与模型组相比,异甘草酸镁治疗组Nox4蛋白水平降低。辐照后1h,细胞磷酸化p38、AKT水平显著增高(P<0.05与Control组相比)。加入异甘草酸镁后,与模型组比,辐照细胞内p38、AKT磷酸化蛋白水平显著降低(P<0.05)。6.Western blot结果显示:辐照后72h,经Nox4和磷酸p38、AKT抑制剂预处理的肺成纤维细胞胞内α-SMA和fibronectin蛋白表达均显著减少(P<0.05与IR组相比)。与单纯辐照组比,异甘草酸镁显著减少辐照细胞内α-SMA和fibronectin蛋白表达(P<0.05)。7.Western blot结果显示:辐照后72h,经si Nox4预处理的肺成纤维细胞内α-SMA和fibronectin蛋白表达显著减少(P<0.05与IR组相比),且异甘草酸镁减少已敲低Nox4的辐照细胞内α-SMA和fibronectin蛋白表达。实验结论:1.成功建立小鼠放射性肺损伤模型。2.异甘草酸镁对放射性肺损伤有保护作用。其作用可能与调控氧化应激反应,降低TGF-β1及其通路smad2/3的表达,抑制p38/AKT/Nox4通路等机制有关。3.异甘草酸镁可明显抑制辐照引起的肺成纤维细胞分化,其作用与干预p38/AKT/Nox4通路有关。