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目的:TBC1D3又称PRC17（前列腺癌基因17）,是人科特有的癌基因,高表达于多种肿瘤细胞,如前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌和骨髓增生异常综合征等。TBC1D3的表达可使正常成纤维细胞NIH 3T3发生恶性转化在裸鼠体内形成肿瘤,亦可延迟EGFR和IRS-1的降解来增强GFs信号,导致细胞增殖和肿瘤发生。GFs信号负反馈调节TBC1D3的稳定性,在E3泛素连接酶CUL7的介导下泛素化和降解TBC1D3,使得TBC1D3的蛋白水平维持动态平衡。钙调蛋白（CaM）参与众多蛋白的稳定性调节,如雌激素受体α（ER-α）和TRE17/USP6等,我们的预实验显示CaM通过抑制TBC1D3的降解提高其稳定性。因此,探讨CaM调节TBC1D3稳定性的机制,将有助于阐明CaM和TBC1D3在肿瘤发生发展中的作用,为肿瘤的诊断和防治提供新线索。方法:1.为了研究CaM对TBC1D3降解的调节作用,我们转染GST-CaM使CaM高表达或使用CaM抑制剂W7抑制内源性CaM功能,通过Western blot和免疫共沉淀实验分别观察MCF-7和BT-549细胞内CaM对TBC1D3降解和泛素化的调节作用。通过抽提细胞浆、细胞核蛋白,观察TBC1D3降解的亚细胞部位及CaM的调节作用。2.为了探讨CaM抑制TBC1D3降解的机制是否通过相互作用,以GST载体为对照,将GST-CaM和Flag-TBC1D3复合转染MCF-7细胞,用抗GST抗体进行免疫共沉淀,检测CaM与TBC1D3之间的相互作用;以Flag载体为对照,将Flag-TBC1D3和GST-CaM复合转染MCF-7细胞,用抗Flag抗体进行免疫共沉淀,反向检测TBC1D3与CaM之间的相互作用;使用Ca2+螯合剂EGTA处理,通过免疫共沉淀分别观察MCF-7和BT-549细胞内CaM与TBC1D3的相互作用;over-lap PCR构建TBC1D3内在缺失突变体Flag-TBC1D3（△157-171）和Flag-TBC 1D3（△ 303-312）,以Flag为对照,分别将GST-CaM和Flag-TBC 1D3及其突变体复合转染MCF-7细胞,抗Flag抗体做免疫共沉淀检测它们与CaM的相互作用,以分析确定TBC1D3氨基酸序列中与CaM相互作用的功能部位;以GST载体为对照,Flag-TBC1D3及其突变体与GST-CaM分别复合转染转染MCF-7细胞,抗GST抗体做免疫共沉淀,反向验证TBC1D3氨基酸序列中与CaM相互作用的功能部位。3.为了分析TBC1D3内与CaM结合部位的功能,用over-lap PCR构建TBC1D3内点突变体Flag-TBC1D3（Y163A-T165A）和Flag-TBC1D3（K166R）。分别转染Flag-TBC1D3、Flag-TBC1D3（△ 157-171）及点突变体,通过Western Blot和CO-IP检测TBC1D3及点突变体的降解水平和泛素化水平;以Flag为对照,将Flag-TBC1D3及点突变体分别和GST-CaM复合转染MCF-7细胞,抗Flag抗体做免疫共沉淀检测它们与CaM的相互作用。4.为了检测TBC1D3的稳定性对细胞迁移的作用,以Flag空载体为对照,与Flag-TBC1D3分别转染MCF-7和BT-549细胞,进行划痕和Transwell迁移实验。为了探讨TBC1D3影响细胞迁移的机制,Flag空载体和Flag-TBC1D3分别转染MCF-7细胞,无血清饥饿24h后,明胶酶谱法检测培养液内MMP-9活性;实时荧光定量PCR和Western blot分别检测细胞裂解物内MMP-9的mRNA和蛋白水平。复合转染GST-CaM,观察CaM对TBC1D3稳定性的调节作用对细胞迁移、MMP-9活性和蛋白水平的影响。结果:1.Westernblot结果表明10%FCS可诱导TBC1D3降解,复合转染CaM并高表达时,10%FCS诱导的TBC1D3降解受到明显抑制,说明CaM能够抑制TBC1D3的降解;使用W7抑制内源性CaM功能后,TBC1D3的降解趋势更加明显,说明内源性CaM在TBC1D3降解中的抑制作用;免疫共沉淀实验显示10%FCS可有效诱导TBC1D3的泛素化,CaM的表达可大大降低TBC1D3的泛素化水平,说明CaM可以降低TBC1D3的泛素化水平;细胞浆、细胞核蛋白抽提实验显示在MCF-7细胞中,10%FCS刺激诱导TBC1D3降解既发生于细胞浆、也发生于细胞核且细胞核内降解趋势更加明显;复合转染CaM并高表达时,TBC1D3细胞浆、细胞核内降解受到明显的抑制,均大大减少。在BT-549细胞中,10%FCS刺激诱导的TBC1D3降解在细胞浆、细胞核内均被检测到且细胞浆内降解趋势更加明显;复合转染CaM并高表达时,TBC1D3细胞浆、细胞核内降解均受到明显的抑制。2.用抗GST抗体进行免疫共沉淀,GST对照组无TBC1D3结合条带,GST-CaM组检测到TBC1D3结合条带,说明TBC1D3与CaM存在相互作用;以抗Flag抗体做反向免疫共沉淀,Flag对照组无CaM结合条带,Flag-TBC1D3组检测到CaM结合条带,说明CaM与TBC1D3存在相互作用;使用EGTA螯合Ca2+后,以抗Flag抗体或抗GST抗体做免疫共沉淀,均未检测到TBC1D3与CaM的相互作用,提示CaM与TBC1D3的相互作用依赖于Ca2+环境。Over-lap PCR构建的TBC1D3缺失突变体Flag-TBC1D3（△ 157-171）和Flag-TBC1D3（△303-312）,经BamHI和XhoⅠ酶切和测序鉴定,序列正确符合预期。以抗Flag抗体或抗GST抗体做免疫共沉淀,结果均显示157位-171位氨基酸缺失后TBC1D3不能与CaM结合,提示TBC1D3蛋白序列上与CaM相互作用的部位可能在N端的157到171位氨基酸之间。3.Over-lap PCR构建的TBC1D3点突变体Flag-TBC1D3（Y163A-T165A）和Flag-TBC1D3（K166R）,经Bam HI和Xho Ⅰ双酶切和测序鉴定,序列正确符合预期。Western blot结果显示 10%FCS可诱导Flag-TBC1D3（Y163A-T165A）降解,而Flag-TBC1D3（△ 157-171）和Flag-TBC1D3（K166R）无明显降解;以抗Flag抗体做免疫共沉淀检测泛素水平,结果显示Flag-TBC1D3（Y163A-T165A）与Flag-TBC1D3均检测到明显泛素化,Flag-TBC1D3（K166R）泛素水平大大降低。以抗Flag抗体做免疫共沉淀,结果显示TBC1D3和TBC1D3（K166R）与CaM存在相互作用,Flag对照和TBC1D3（Y163A-T165A）无CaM结合条带,提示CaM抑制TBC1D3的降解是通过与TBC1D3相互作用抑制K166的泛素化。4.细胞划痕和Transwell迁移实验结果显示,转染Flag-TBC1D3的MCF-7和BT-549细胞迁移能力明显强于转染Flag空载体;实时荧光定量PCR结果显示TBC1D3可上调MMP-9mRNA水平,Western blot检测显示TBC1D3可上调MMP-9蛋白水平,明胶酶谱实验显示TBC1D3可增强MMP-9活性,提示TBC1D3促进乳腺癌细胞迁移可能是通过上调MMP-9的蛋白和活性水平。复合转染CaM时,TBC1D3上调的MMP-9的蛋白和活性水平以及诱导的细胞迁移均被增强。结论:1.CaM增强人乳腺癌细胞浆、细胞核TBC1D3蛋白的稳定性。2.Ca2+/CaM与TBC1D3的N端157位-171位氨基酸序列相互作用。3.泛素化位点K166突变增强人乳腺癌细胞内TBC1D3蛋白的稳定性。4.CaM增强TBC1D3诱导的人乳腺癌细胞MMP-9活性和细胞迁移。