丝胶蛋白是构成蚕丝的主要蛋白之一,具有良好的生物活性和无免疫原性,已成为组织工程领域备受青睐的新兴生物材料。近年来人们已制备了多种丝胶蛋白水凝胶并用于组织损伤修复,然而由于这些水凝胶机械性能差而使其应用受到很大的限制。丝胶蛋白水凝胶的机械强度与成胶前的丝胶蛋白的浓度和分子量大小关系密切,为此,本研究探索从蚕体中直接获取无损伤、高浓度的丝胶蛋白,并在此基础上采用共价交联制备具有高机械强度的新型丝胶蛋白水凝胶,然后对该水凝胶的理化特性和细胞相容性进行了系统地表征,获得了具备高强度特性的丝胶水凝胶,为丝胶蛋白新材料的开发和应用提供了新的思路和技术。另外,本文也报道了一种基于丝胶蛋白和聚丙烯酰胺制备的具有高透明特性的互穿双网络水凝胶敷料。1.高机械强度丝胶蛋白水凝胶的研究(1)高浓度、无损伤丝胶蛋白液的提取与分子量鉴定选取丝素缺失型家蚕品种185 Nd-s采用桑叶在标准环境下饲养至5龄成熟期,解剖中部绢丝腺直接获得了浓度高达16.1%(w/v)粘稠状丝胶蛋白液。采用聚丙酰胺凝胶电泳对该丝胶蛋白的分子量进行了检测,从家蚕体内提取的丝胶蛋白有五条条带,条带完整无拖尾,说明了丝胶蛋白保持了一定的分子量未被破坏,即从家蚕体内提取出的丝胶蛋白能够保持完整性。(2)高机械强度丝胶蛋白水凝胶的制备及交联剂的优化将适量过氧化氢与丝胶蛋白溶液在室温混匀,即可获得丝胶蛋白水凝胶。采用过量的过氧化氢与丝胶蛋白反应,通过检测过水凝胶中残余的过氧化氢,从而推算出参加反应的过氧化氢的量。最后得出,丝胶蛋白溶液(16.1%,w/v)与过氧化氢(3%,w/v)最佳配比为100:1.8(v/v)。并采用优化后的条件将丝胶蛋白与交联剂充分混合。(3)丝胶蛋白水凝胶理化性能表征该丝胶蛋白水凝胶成胶速度快,在室温数十秒钟即可成胶,表明该水凝胶可原位成胶。采用扫描电镜(SEM)观测丝胶蛋白水凝胶的微观结构,结果显示丝胶蛋白水凝胶冻干支架呈多孔的网络状结构,其孔径因水凝胶在不同温度下处理而不同,在-80℃和-196℃下处理获得的冻干支架孔径分别为62μm和22μm。水凝胶的孔隙率在-80℃和-196℃下分别为62%和66%。采用红外光谱仪(FTIR)和X衍射(XRD)评价丝胶蛋白成胶前后二级结构的变化情况,FTIR检测结果显示丝胶蛋白成胶前后β-折叠、无规卷曲、α螺旋、β-转角含量分别为35.62%、46.56%、0、17.82%和38.30%、0、37.01%、24.69%。结果表明,丝胶蛋白成胶后,大量无规则卷曲转化为α螺旋结构,增强了水凝胶的结构稳定性;XRD检测结果发现,成胶前后丝胶蛋白的二面角特征峰未发生明显偏移,证明了丝胶蛋白在转变为水凝胶的过程中其晶体结构未发生明显改变。丝胶蛋白水凝胶具有良好的膨胀性能,在不同pH条件下,其最大膨胀率不同,在24小时内丝胶蛋白水凝胶快速膨胀随后膨胀速率放缓,在312小时的持续膨胀过程中,水凝胶在酸性环境中最高膨胀至自身体积的322%,在中性和碱性条件下分别膨胀至352%和398%。丝胶蛋白水凝胶具有可降解性,在45天的降解过程中,累积降解达50%。丝胶蛋白水凝胶具有优异的药物缓释能力,其可维持释放达40天以上。在初始10天之内药物释放速率较快,前10天药物累计释放达49%,其后药物释放速率放缓,在40天持续释放高达80%。采用万能测试机检测水凝胶的机械性能,结果表明丝胶蛋白水凝胶具有良好的机械性能,其最大拉伸强度高达80 kPa,最大压缩强度超过800 kPa,该水凝胶的拉伸强度和压缩强度远高于已报道的丝胶蛋白水凝胶。此外该水凝胶具有良好的弹性,当其压缩率达到70%,撤去外力后,该水凝胶的长度能恢复至初始长度的60%。(4)丝胶蛋白水凝胶的细胞相容性研究将水凝胶破碎后加入到含小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)的细胞培养板中培养,并且以不含水凝胶的细胞培养平板中的细胞作为对照,在24 h、48 h时间点用cck8的方法检测细胞的活性。研究结果表明,丝胶蛋白水凝胶组的细胞和对照组的细胞相比无显著性差异。2.聚丙烯酰胺-丝胶蛋白互穿双网络(interpenetrating double-network IPN)水凝胶创伤敷料研究在本实验室前期关于聚丙烯酰胺-丝胶蛋白互穿双网络水凝胶研究的基础上,本文从敷料的角度进一步对该水凝胶的细胞学特性和在皮肤损伤修复方面的潜在应用进行了研究。研究结果表明,不同配方制备的丝胶蛋白-聚丙烯酰胺水凝胶细胞粘附性不同,IPN水凝胶的细胞粘附性随着丝胶蛋白含量增加而增强,其中S50P50细胞粘附性最佳,与对照组相比无显著性差异。通过显微镜观察细胞生长情况发现,种植于IPN水凝胶上的细胞,随着时间的延长,细胞持续增殖,S50P50样品上的细胞密度和对照组细胞培养板上的相似。通过cck8试剂盒检测细胞活力,IPN水凝胶的细胞活力随着丝胶蛋白含量的增加而增强,其中S50P50样品中细胞活力最佳,与细胞培养板中培养的细胞(对照组)相比无显著性差异。此外,该水凝胶具有高透明特性,将其覆盖于小鼠伤口表面,可清晰地看到创面的情况而无需揭开水凝胶敷料,表明该水凝胶有望作为一种高透明创伤敷料应用于皮肤损伤修复。