在许多神经退行性疾病中都存在脑铁增高的现象，如帕金森氏病(Parkinson disease，PD)和阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)。铁水平增高引起的氧化损伤和对细胞抗氧化机制的破坏很可能是这些疾病中神经元死亡的原因。然而关键问题是在某些脑区铁水平为什么会异常的增高?Ferroportin 1(FPN1)是新发现的一种铁运输蛋白，可以通过肠吸收细胞的基底侧细胞膜把铁运出细胞。最近发现，在脑内也存在FPN1，但FPN1在脑内的分布、表达调节和功能仍不明确，血脑屏障细胞是否有FPN1表达还存在很大争议。本论文用原位杂交、免疫组织化学和细胞转染的方法研究了FPN1在脑内的表达和分布，用RT-PCR和Western Blot研究了铁状态、NO和年龄对神经细胞FPN1表达的调节，用液闪测量方法检测了FPN1在神经细胞铁代谢中的作用。 原位杂交结果显示，FPN1 mRNA定位于神经细胞的细胞质中，主要分布在皮层、海马、黑质致密部、尾壳核和缰内侧核等脑区。在大脑皮层分布有大量的阳性锥体神经元，轮廓清楚。黑质阳性神经细胞比其周围的脑区明显增多，大部分阳性细胞分布在黑质致密部。在靠近齿状回的海马CA4区锥体细胞层，分布有大量阳性的锥体细胞。在尾壳核，FPN1 mRNA阳性细胞分布在神经纤维周围。 免疫组织化学结果显示，FPN1蛋白主要存在于神经细胞的细胞膜上，细胞质中也有少量分布，细胞核中无表达。在不同脑区FPN1蛋白的分布特点与其mRNA的分布特点基本一致。在大脑皮层，除了分子层以外，其他各层都分布有大量的阳性细胞，锥体细胞的胞体和初级突起呈现明显的强阳性。用酪胺酸羟化酶免疫组织化学染色进行黑质定位显示，黑质致密部的多巴胺能神经元呈现FPN1强阳性，阳性颗粒主要在神经元胞体的细胞膜和突起中。海马锥体细胞层分布有大量的阳性细胞。缰内侧核阳性细胞的密度很高，在各脑区中阳性最强。 用RT-PCR的方法发现脑毛细血管内皮细胞能够表达FPN1和TfR mRNA，内皮细胞FPN1的表达水平要高于去内皮的皮层组织，而TfR mRNA在内皮细胞和去内皮脑组织的表达则没有明显差异。免疫组织化学方法显示脑内毛细血管内皮细胞和室管膜细胞表达FPN1蛋白。博士学位论文:FerroPoninl在脑内的分布、调控和功能 在皮层和纹状体，大鼠从1周龄到9周龄，FPNI mRNA表达增强;从9周龄到18月龄，FPN 1 mRNA表达明显降低。在皮层和黑质，随着年龄的增长，FPNI蛋白表达呈下降趋势。在缓内侧核，FPNI表达最强，但不同年龄组之间无明显差异。 本研究成功构建了pEGFP一1/F PNI融合基因，来研究FPNI在神经细胞的亚细胞定位。用pEGFP一FPNI转染C6细胞，激光共聚焦扫描显微镜下观察，绿色荧光蛋白集中在胶质瘤细胞的细胞膜上，表明FPNI主要分布在神经胶质细胞的细胞膜上，是一种膜蛋白。 RT一PCR的方法显示，PC 12细胞可以表达T很和FPNI mRNA。用100 p mol几FAC孵育细胞20h，使细胞处于高铁状态下，T很mRNA的表达量降低了约70%，F州1 mRNA的表达量降低了约50%;铁的鳌合剂DFO(100 p mo一/LforZOh)和NO生成剂sNAP(0.5 mmol/L and lmmol/L for 20h)都使T仅and FPNI mRNA的表达增高。 用Western Blot方法研究了铁状态和NO对PC12细胞中FPNI蛋白表达的影响。结果发现FAC(1 00 p mol/L，Zoh)使FpNI蛋白表达降低幼<0 .05)，而DFo(100“mol/L，Zoh)使FPNI蛋白表达显著增高，<0.01)。分别用0.5 nunoFL and lmmol/LSNAP处理细胞ZOh，FPNI蛋白表达量分别增高了1倍和2倍，呈浓度依赖关系。 本研究用液闪测量方法检测了FPNI在神经细胞铁代谢的作用。同位素Fe2+孵育细胞后30分钟内，对照组c6细胞释放了34%的同位素Fe2+，而抗体处理组细胞只释放了15%的同位素Fe2+，两组之间差异显著(P<0.05)。FPNI抗体使细胞的Fe2+释放量减少了约50%。 结论: FPNI在脑内分布广泛，主要分布在皮层、海马、黑质致密部、纹状体和疆内侧核等脑区。我们的实验为FPNI在脑内分布及在血脑屏障内皮细胞和室管膜细胞中的存在提供了直接实验证据。由此推测，铁穿过血脑屏障的过程可能与穿过肠道上皮细胞的过程相似，FPNI在血脑屏障铁转运的过程也可能起着铁输出作用。另外，FPNI在缓内侧核表达最高，疆内侧核毗邻第三脑室，可能是脑内的铁代谢中心之一。 PC12细胞在低铁状态下FPNI mRNA和蛋白表达增高，高铁状态下FPNI表达降低。用SNAP处理细胞，FPNI的表达增高。尽管FPNI具有5’一IRE序列，但其表达的调控机制具有组织和细胞特异性。在神经细胞中，铁状态和NO对FPNI表达的调节很可博士学位论文:FerroPortinl在脑内的分布、调控和功能能首先是在转录水平上进行，IRE八RP系统可能起辅助的微调作用。 本论文用动物细胞转染的方法发现FPNI蛋白主要分布于神经细胞的细胞膜上，用液闪测量方法发现FPNI抗体使C6细胞的铁释放量减少了50%。这说明FPNI是一种跨膜铁输出蛋白，在神经细胞中起着铁输出的作用，可以通过神经细胞的细胞膜把铁运出细胞。老年大鼠脑内的FPNI mRNA和蛋白的表达均较低，FPNI的功能下调就会引起相应脑组织内铁的积累，引起的氧化损伤，破坏细胞抗氧化机制，?