目的:骨质疏松症(osteoprosis,OP)是一种由成骨细胞的骨形成功能异常和(或)破骨细胞的骨吸收功能异常所导致的以骨量和骨强度减弱为特征的代谢性骨病,严重危害人类健康,目前有研究表明自噬参与了骨质疏松症的发病过程。二甲双胍(metformin,MF)是一种治疗2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)的药物,部分研究发现二甲双胍还能促进成骨细胞分化。但二甲双胍在促进成骨细胞分化的过程中是否与自噬存在关联,目前这方面研究还存在空缺,本文就从该角度出发,以小鼠成骨细胞前体细胞MC3T3-E1细胞系为研究对象,来探讨自噬在二甲双胍促进MC3T3-E1细胞系成骨分化中的作用。研究方法:1.不同浓度的MF(0,200μmol/l,400μmol/l,800μmol/l)处理MC3T3-E1细胞后,利用碱性磷酸酶(ALP)染色检测细胞成骨分化能力的变化。利用免疫印迹(Western blot)检测LC3和P62蛋白的表达及免疫荧光检测LC3蛋白荧光强度来评估细胞自噬活性的改变。从上述四个浓度中选择出最佳干预浓度。2.实验分组:对照组(CON组),MF组(最佳干预浓度400μmol/l),MF(最佳干预浓度400μmol/l)+自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA,5mmol/l)组,3-MA(5mmol/l)组。四组药物分别处理细胞后,利用Western blot检测LC3和P62蛋白的表达、免疫荧光检测LC3蛋白荧光强度、透射电镜(TEM)检测自噬体数量来评估自噬活性的改变,并通过ALP染色、半定量RT-PCR检测骨钙素(OCN)和I型胶原(COL1)基因的表达、Western blot检测OCN和COL1蛋白的表达来检测成骨能力的变化。结果:1.MF在0-400μmol/l浓度范围内干预MC3TE-E1细胞系,随MF的浓度增加,细胞的ALP活性逐渐增强;LC3 II/I的比值逐渐增大,MF0与MF400比较,P<0.05,MF200与MF400比较,P<0.05;P62蛋白表达逐渐减弱,MF0与MF400比较,P<0.001,MF200与MF400比较,P<0.05;LC3免疫荧光强度逐渐增强,MC3T3-E1细胞系的自噬强度和成骨能力与MF的干预浓度呈剂量依赖性,MC3T3-E1的自噬强度和成骨能力正相关,其中400μmol/l MF组,MC3T3-E1的自噬强度最强,成骨分化能力最强,为最佳干预浓度。800μmol/l MF组干预细胞,和400μmol/l MF组相比,细胞的ALP活性开始下降;LC3II/I的比值下降,P<0.05;P62蛋白表达增多,P<0.001;LC3免疫荧光强度下降。2.CON,MF,MF+3-MA,3-MA四组干预细胞后,MF组中自噬指标LC3II/I比值增大,P62蛋白表达减少,LC3荧光强度增强,自噬体数量增多,自噬活性增加;成骨指标ALP活性增强,成骨相关基因和蛋白OCN,COL1的表达增强,成骨能力增强。MF中加入3-MA后,和MF相比,细胞自噬指标LC3 II/I的比值减小,P<0.05;P62蛋白表达增多,P<0.05;LC3荧光强度减弱,自噬体数量减少,MF+3-MA组自噬活性减弱;成骨指标ALP活性减弱,OCN基因表达减弱,P<0.01;COL1基因表达减弱,P<0.05。OCN蛋白表达减弱,P<0.05;COL1蛋白表达减弱,P<0.05,MF+3-MA组成骨能力减弱。自噬抑制剂3-MA减弱了二甲双胍对MC3T3-E1细胞系的成骨促进效应。结论:在0-400μmol/l浓度范围内,MC3T3-E1细胞系的自噬强度和成骨能力与二甲双胍的干预浓度呈剂量依赖性;MC3T3-E1细胞系的自噬强度和成骨分化能力正相关;二甲双胍能通过激活MC3T3-E1细胞系的适度自噬促进其成骨分化。