随着组合化学等新技术的发展,被合成及被发现的化合物越来越多,它们对毒性筛选的需求也越来越迫切。传统的毒性评价实验需要消耗大量的实验动物与受试化合物,而且实验周期长、耗资大,不能满足新化合物研发的需求,因此,建立符合“4R”原则的体外毒性高通量筛选方法(High Throughput Screening,HTS)已成为毒理学方法学研究的一个重要发展趋势。 HTS 是上世纪末发展起来的一种高新技术,与传统的筛选试验相比,它具有快速、灵敏、所需化合物的样本量少等优点,现已广泛用于先导化合物和药效的筛选。如将 HTS 技术与毒性试验相结合,建立高通量的毒性筛选方法,能够在早期发现不适于进一步研究开发的新化合物,及时对化合物作出取舍决定,这无疑具有重要的实际意义。急性毒性和遗传毒性是从毒理学角度决定新化合物是否适于进一步研究开发的主要依据,因此成为目前国际上在这方面的研究热点之一。本研究的目的是建立可用于高通量筛选急性毒性与遗传毒性的试验方法,为建立急性毒性与遗传毒性体外高通量筛选系统提供科学依据。一、 急性毒性的体外高通量筛选方法的建立 LD50 是目前公认的衡量化合物急性毒性的主要指标,但作为替代整体动物试验的体外细胞毒性尚无明确公认的指标。国外已有资料表明,体外的细胞毒性指标 IC50-IC30 与体内的急性毒性评价指标 LD50 间有良好的相关性,它们在很大程度上反应了体内的急性毒性作用。因此,本研究内容之一是拟通过分析 IC50-IC30与体内急性毒性 LD50的相关性,确定一个体外的评价指标 ICX。 目前检测细胞毒性的方法中一般认为以 LDH 法、中性红法、MTT 法及刃天青法较好,也较常用。本研究的内容之二是通过对这四种不同的检测方法进行比较,以筛选一种相对适于体外筛选的方法。 本研究选用 47 种不同毒性的受试化合物作用于体外微孔板培养的人肝肿瘤细胞HepG2细胞,用四种不同的检测细胞毒性的方法进行检测,分别计算了IC50、IC45、IC40、IC35 及 IC30 的值,并对它们各自与 LD50 的相关性进行线形拟合,通 3<WP=6>过系统的比较四种检测方法及五种检测指标,最后确定一个与 LD50 相关系数最大的 IC45为体外评价指标(R2=0.7793)。 通过对四种检测方法的比较,结果表明,中性红法测得的检测指标与 LD50的相关性要比其它三种方法好,且具有统计学意义,故可认为,中性红法的检测结果能很好的反映体内实验结果,因此确定该法为体外毒性检测方法。 本研究所采用的 47 种受试物,结构不同,机制各异,毒性亦各不相同(高毒占 8.51%,中等毒占 14.89%,低毒占 42.55%,微毒占 34.04%),因此本研究选用的受试物不论是在数量上还是在性质上都有良好的代表性。本研究选用的人肝肿瘤细胞 HepG2 细胞株是一种来源于人类肝脏的细胞株,因此具有一定的人类肝脏细胞代谢酶的活性,能够在体外模拟体内的代谢活化环境,所以本研究结果能较好的反映体内实验情况。本研究采用了体外微孔板细胞培养技术,所需受试化合物的量仅为以前的 1/500-1/1000,并可在一块 96 孔板上同时筛选 3 种受试化合物,提高了通量,实现了微量化,故可认为,初步成功的建立起了符合“4R”原则的急性毒性体外高通量的筛选方法。二、 遗传毒性的体外高通量筛选方法的建立 彗星实验由于能检测出 DNA 的单链断裂、DNA 的双链断裂、DNA-DNA链内交联、DNA-DNA 链间交联、DNA-蛋白交联、碱不稳定位点及延迟修复位点等多个遗传毒性终点,且能反映单个细胞的遗传损伤情况,因此已被广泛应用,并被认为是最有可能替代微核实验成为继 Ames 实验后第二大遗传毒性评价实验,但由于经典的彗星实验为体内实验,不适应高通量筛选的要求,因此,本研究的目的是将经典的体内彗星实验改进成体外高通量的彗星实验。 本研究采用人肝肿瘤细胞 HepG2 细胞,运用微孔板细胞培养技术,建立体外彗星实验。本研究选取了 20 种受试化合物对该方法进行了验证,其中,非遗传毒物 12 种,占 60%,遗传毒物 8 种,占 40%。在遗传毒物中,直接诱变剂 4种,间接诱变剂 4 种。用该方法共检出 10 种具有遗传损伤的物质,其中遗传毒物 8 种,非遗传毒物 2 种;10 种未检出具有遗传毒性的受试物均为非遗传毒物,故该方法的灵敏度为 100%,特异度为 83%。 本研究建立的 HepG2 细胞彗星试验其主要优点是替代了实验动物,缩短了实验周期、优化了实验设计;实现了微量化,大大降低了受试化合物的消耗量(约 4<WP=7>为以前用量的 1/100-1/500);提高了筛选的通量,在一块 96 孔板上可同时对 4种受试化合物进行遗传毒性的检测;同时具有一定的灵敏度、特异度与重现性。另外,采用在体外具有活化代谢能力的人肝肿瘤细胞 HepG2 细胞,能更好的反映体内的实验结果,本研究在不加体外代谢活化系统 S9 的情况下,检测了 4 种间接诱变剂均获阳性结果。故可认为,本研究建立的体外高通量遗传毒性筛选方法是初步成功的。综上所述,可以认为本研究初步成功的建立了急性毒性与遗传毒性体外高通量筛选方法,有望在进一步做大规模的验证、改进后成为化学物早期毒性筛?