选择性宫内生长受限（selective intrauterine growth restriction,sIUGR）是单绒毛膜双羊膜囊的特有并发症,在单绒双胎中发生率约10%～15%^[1]。目前公认的诊断标准为小胎儿体重小于生长曲线的第10百分位及双胎估计体重（estimated fetal weight,EFW）相差>25%^[2]。sIUGR常伴发胎儿神经系统损伤,容易发生胎儿宫内死亡,对围产儿的预后造成严重威胁。随着对基础研究的逐步深入,对sIUGR的基础研究关注点也深入到分子机制。针对sIUGR的发病已经衍生出诸如胎盘份额不均及脐带插入异常^[3,4]、胎盘血管吻合异常^[5]、氧化应激^[6]、表观遗传修饰^[7]等多种假说。尽管已有一些理论和假设被提出和论证,然而sIUGR确切的发病机制至今仍不明确。miRNA是一类真核生物内源性小分子单链RNA,通过与靶m RNA特异性的碱基配对引起靶m RNA的降解或者抑制其翻译,从而对基因转录后表达进行调控^[8]。大约30%的人类基因表达可能受miRNA调控,参与细胞增殖、分化、代谢和凋亡等在内的所有生命过程。功能学研究表明,miRNA在调节胎盘发育和功能发挥中起重要作用,近些年来多项研究结果显示,在多种妊娠相关疾病如子痫前期、胎儿生长受限、早产等,都发现了相应异常表达的miRNA^[9-11],这些miRNA的异常表达与疾病的发生、发展、预后等相关。选择性宫内生长受限的病因中胎盘发育不一致是其主要因素,胎盘发育与滋养细胞对子宫蜕膜的侵袭密切相关,滋养细胞的增殖、侵袭和迁徙等生物学行为,与恶性肿瘤相似。我们发现,与正常的单绒毛膜双羊膜双胎相比,sIUGR两个胎儿的14种胎盘源性miRNA有差异表达,提示这些miRNA可能参与sIUGR的发生过程,然而其具体发病机制尚不明确。miR-338-5p是近年来研究发现的一类调节细胞生长,分化,与肿瘤发生有密切联系的miRNA。研究证实在多种恶性肿瘤组织中有异常表达的miRNAs,进而影响了肿瘤细胞在增殖、侵袭、转移等生物学行为方面的异常^[12]。我们发现miR-338-5p在sIUGR大胎儿的胎盘组织中的表达显著低于小胎儿胎盘组织,推测miR-338-5p的异常表达有可能影响滋养细胞的生长过程,进而参与了sIUGR发病的相关机制。本研究的目的是检测sIUGR及正常单绒毛膜双羊膜囊双胎的胎盘组织中的miRNA的表达,建立胎盘源性miRNA表达谱。同时在HTR-8/SVneo细胞中研究miR-338-5p异常表达对滋养细胞的增殖、侵袭和迁徙的影响,并进一步探索miR-338-5p参与调控滋养细胞的分子机制在sIUGR发生发展中的作用。第一部分建立选择性生长受限胎儿的胎盘源性miRNA表达谱目的:通过对sIUGR及正常单绒毛膜双羊膜囊双胎的胎儿胎盘组织进行基因测序,比较其差异,建立sIUGR胎盘源性miRNA表达谱。方法:用miRNA芯片检测sIUGR胎儿及正常单绒毛膜双羊膜囊双胎不同体质量的胎儿的胎盘组织,比较sIUGR胎儿和正常单绒双羊胎儿的胎盘组织miRNA表达差异,建立sIUGR胎盘源性miRNA表达谱。结果:1.通过对miRNA芯片结果进行聚类分析,发现sIUGR不同体质量胎儿的胎盘组织中有45种miRNA差异表达显著（p<0.05）。2.对sIUGR与正常MCDA不同体质量胎儿的胎盘差异miRNA聚类分析比较,在sIUGR胎盘差异miRNA中分别有7种表达上调的miRNA和7种表达下调的miRNA为其特有。结论:sIUGR不同体质量胎儿的胎盘组织之间存在差异表达miRNA,这些胎盘源性miRNA与sIUGR的发生发展可能相关。第二部分选择性生长受限胎盘源性的差异表达miRNA的生物信息学研究及PCR验证目的:根据基因芯片结果,构建sIUGR胎盘源性miRNA与靶基因的调控网络,并对sIUGR胎盘组织的miRNA表达谱进行PCR验证。方法:基于miRNA芯片结果,通过Gene Spring软件进行靶基因预测,筛选后通过DAVID数据库进行靶基因功能富集分析和信号转导通路富集分析,通过Cytoscape软件构建miRNA通路网络和信号通路网络。收集15例sIUGR和15例正常单绒双胎的胎盘组织进行分析,提取胎盘组织miRNA,通过Real Time-PCR技术对miR-5189-5p、miRNA-1、miR-370-3p、miR-373-3p、miR-338-5p、miR-590-5p的表达进行检测,验证芯片的预测结果。结果:1.在sIUGR组大体质量胎儿的胎盘组织中,上调的胎盘源性miRNA的靶基因有712个,下调的miRNA靶基因有929个。2.对14个miRNA的靶基因进一步做GO和Pathway分析,发现7个上调的miRNA涉及101条信号通路,而7个下调的miRNA涉及49条信号通路。3.核心miRNA涉及的核心信号通路有MAPK信号通路、TGF-β信号通路、Wnt信号通路和HTLV感染通路。4.sIUGR的大体质量胎儿胎盘组织PCR验证发现,miR-5189-5p、miR-1、miR-370-3p表达上调;而miR-373-3p、miR-338-5p、miR-590-5p表达下调,差异具有显著性（p<0.05）,与miRNA的芯片检测结果相符。5.涉及信号通路较多的前5位miRNA在大体质量胎儿的胎盘中均表现为下调。结论:1.sIUGR胎盘源性miRNA涉及多个信号通路,其核心通路有MAPK信号通路、TGF-β信号通路、Wnt信号通路和HTLV感染通路。2.miR-338-5p可能与sIUGR致病相关。第三部分miR-338-5p对HTR-8/SVneo滋养细胞增殖、侵袭和迁移的影响目的:探讨miR-338-5p对HTR-8/SVneo滋养细胞增殖、侵袭和迁移能力的改变。方法:培养HTR-8/SVneo细胞,使用miRNA-338-5p inhibitor转染,抑制miR-338-5p的表达,q RT-PCR检测鉴定干扰效价。用CCK-8法检测miR-338-5p抑制后滋养细胞增殖情况,Transwell法检测滋养细胞侵袭能力,划痕实验检查细胞迁徙能力的改变。结果:1.miR-338-5p inhibitor转染HTR-8/SVneo滋养细胞,48h后用q RT-PCR检测miR-338-5p的表达量显著下调（p<0.0001）。3.CCK-8检测转染miR-338-5p inhibitor 72h后HTR-8/SVneo滋养细胞增殖能力显著升高（p<0.01）。4.Transwell结果显示转染miR-338-5p inhibitor 48h后HTR-8/SVneo滋养细胞的侵袭增强（p<0.01）。5.划痕实验结果显示转染miR-338-5p inhibitor 48h后HTR-8/SVneo滋养细胞的迁移能力增强（p<0.0001）。结论:miR-338-5p降表达后HTR8/SVneo细胞增殖、侵袭与迁移能力增强。第四部分miR-338-5p在sIUGR中靶向抑制EFEMP1的表达目的:预测和识别miR-338-5p在sIUGR中调控的靶基因。研究在miR-338-5p在HTR-8/SVneo细胞中对EFEMP1的调控。方法:1.通过q RT-PCR、免疫组化及Western-blot检测在sIUGR胎盘组织中miR-338-5p与EFEMP1的表达。2.通过荧光素酶报告基因实验检测EFEMP1是否为miR-338-5p的靶基因。3.通过RT-PCR和western-blot分析HTR-8/SVneo细胞转染miR-338-5p inhibitor 48h后EFEMP1表达的改变。结果1.在sIUGR胎盘组织中,miR-338-5p与EFEMP1表达呈负相关。2.miR-338-5p能够显著的抑制野生型报告基因载体EFEMP1-3’UTR-psiCHECK2的荧光素酶活性,而对突变型报告基因载体Mut-EFEMP1-3’UTR-psiCHECK2的荧光素酶活性没有影响（p<0.01）。3.与阴性对照相比,转染miR-338-5p inhibitor后,滋养细胞的EFEMP1的表达增加（p<0.001）。结论:1.与小体质量的胎儿胎盘组织相比,sIUGR的大体质量胎儿的胎盘组织中miR-338-5p表达下调,而EFEMP1表达增加。2.在HTR-8/SVneo细胞中降表达miR-338-5p后,细胞的EFEMP1的表达上调。3.EFEMP1是miR-338-5p的靶基因之一。