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EB病毒(Epstein-barr virus, EBV)属于人类疱疹病毒γ家族,广泛存在人群中,成人感染率达到90%以上,是第一个公认的致肿瘤病毒。鼻咽癌和淋巴瘤是常见的恶性肿瘤,是EBV潜伏感染、环境和宿主基因遗传等多种因素共同参与、相互作用而逐步形成的复杂性疾病,预后较差。几乎所有的鼻咽癌细胞以及大多数的淋巴瘤细胞能够检测到EBV基因组的存在,并通过编码表达潜伏膜蛋白(Latent membrane protein, LMP)1-LMP2参与疾病的发生、发展以及转移,这使得这些病毒蛋白成为理想的肿瘤靶抗原,为进行过继性细胞免疫治疗提供了有利的条件。肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte, CTL)是由抗原提呈细胞(Antigen presenting cell, APC)摄取加工肿瘤特异性抗原肽,协同白介素(Interleukin)-2等细胞因子的作用,体外激活初始T淋巴细胞生成的。因LMP1、LMP2免疫原性较低,如何选择合适的APC稳定的制备数量充足、活性良好的CTL是对上述两种EBV阳性肿瘤进行过继性免疫治疗的关键。目的本研究拟选择树突状细胞(Dendritic cells, DC)以及EBV转化B淋巴细胞生成的永生化淋巴母细胞系(Lymphoblastoid cell lines, LCLs)作为两种APC,体外制备稳定增殖的EBV特异性CTL,并通过多种方法检测EBV-CTL对EBV阳性肿瘤细胞的杀伤作用,为选择合适的APC进行下一步的临床研究提供理论基础。方法1.T淋巴细胞的培养：分离人外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC),经CD3、CD28单克隆抗体刺激后,在IL-2的作用下大量扩增外周血T淋巴细胞。CCK-8检测不同培养条件对细胞增殖的影响,选择合适的培养基用于细胞的培养。2.DC细胞的制备：PBMC贴壁分离,在IL-4、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)等细胞因子作用下诱导生成DC细胞并通过负载LMPs混合多肽刺激DC成熟,流式细胞仪检测细胞表面分子的表达。3.LCLs的构建：制备EBV病毒上清,按比例混合完全培养基培养PBMC,诱导生成LCLs。通过流式细胞仪检测细胞表面分子的表达,RT-PCR扩增细胞基因组,了解细胞的生物学特征。4.丝裂霉素灭活LCLs:CCK-8检测不同浓度丝裂霉素灭活后LCLs增殖速度,绘制增殖曲线,选择灭活程度彻底、损伤小的浓度作为合适的灭活条件。5.EBV-CTL的生物学活性研究：负载抗原的DC及灭活后LCLs作为APC体外诱导T淋巴细胞生成EBV-CTL,通过CCK-8、流式细胞仪、ELISA等方法对EBV-CTL体外杀伤肿瘤细胞、分泌IFN-γ的能力进行分析判断。结果1.对四种培养条件下T淋巴细胞增殖情况进行分析：1640+10%FBS与GT-T551+2%自身血浆两种培养条件下细胞增殖在第9天达到80倍。2.制备的DC形态不规则,边缘有明显的毛刺状突起。流式细胞仪检测细胞表面分子CD83、CD86的表达有明显提高,表达量分别为42.07%及45.09%。3.成功构建LCLs,流式细胞仪检测细胞表面高度表达CD40、CD19、CD80、CD86分子,表达量分别为97.23%、90.06%、85.97%、50.41%；RT-PCR成功扩增LMP1、LMP2基因片段。4.100μg/ml、150μg/ml丝裂霉素灭活LCLs后对细胞进行培养,细胞增殖明显被抑制,24h后反应达到稳定状态,细胞停止增殖。5. DC-EBV-CTL体外杀伤鼻咽癌细胞和淋巴瘤细胞24h,杀伤率分别为77.15%±3.18%,58.72%±6.30%,同时IFN-γ的分泌量为491.244±23.80pg/ml; LCLs-EBV-CTL对鼻咽癌细胞和淋巴瘤细胞的杀伤率分别72.72%±8.45%、75.6%；杀伤过程中LCLs-EBV-CTL中分泌IFN-γ的细胞比例为25.04%,增加了12.3倍。结论1.1640+10%FBS与GT-T551+2%自体血浆两种培养基可以很好地促进细胞的增殖,选择1640+10%FBS作为下一步基础实验中T淋巴细胞的完全培养基。2.制备的DC具有典型的形态学特征,细胞表面高度表达CD83、CD86分子,提示为成熟DC细胞,具备抗原提呈能力。3.LCLs构建成功,高度表达细胞表面分子CD40、CD19、CD80、CD86,提示细胞来源于B淋巴细胞,具备抗原提呈能力；RT-PCR成功扩增LMP1、LMP2基因片段,证明细胞转化成功,可作为APC提呈EBV特异性抗原。4.诱导生成的DC-EBV-CTL、LCLs-EBV-CTL对EBV阳性的鼻咽癌细胞及淋巴瘤细胞具有高度特异性杀伤作用,两种EBV-CTL在抗原再次刺激后均可以分泌大量的IFN-γ,间接影响免疫反应。