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[研究背景]核因子κB(nuclear factor of kappa B,NF-κB)是细胞内一类可诱导激活的转录因子,受其调控的靶基因包括细胞因子、趋化因子、生子因子、氧化应激相关酶及急性期蛋白等,在机体的炎症反应、获得性免疫反应、细胞存活等生命活动过程中发挥着重要的作用。因此,细胞中NF-κB信号通路的激活必定要受到严密的调控。在未受刺激的细胞,NF-κB转录因子主要与它的抑制蛋白IκB(inhibitor of kappa B)相互结合,使其核定位序列(nuclear localization sequence,NLS)被掩盖而定位在细胞浆中,不能启动下游靶基因的表达。当细胞受到脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor,TNFα)、紫外线(ultraviolet,UV)等多种刺激时,这些刺激可以分别通过其各自的信号转导通路激活IκB激酶(IκB kinase,IKK)蛋白激酶复合物。被激活的IKKβ蛋白激酶可以进一步催化IκBα的特定丝氨酸残基发生磷酸化修饰,磷酸化的IκB蛋白可进一步发生泛素化修饰,并通过ATP依赖性的26S蛋白酶体途径被降解,从而释放出与其相互结合的NF-κB二聚体,NF-κB二聚体再移位入核而调控其靶基因的表达。泛素化修饰是蛋白质翻译后修饰的一种重要形式。蛋白质发生泛素化修饰通常需要三种酶的参与:E1泛素激活酶(ubiquitin activating enzymes)、E2泛素偶联酶(ubiquitin conjugating enzymes)和 E3 泛素连接酶(ubiquitin ligases)。其中,E3泛素连接酶处于核心的地位,它通过与底物蛋白质的直接结合而保证了细胞中发生泛素化修饰蛋白质的特异性。在E3泛素连接酶家族中,近年来一类以Cul3蛋白为核心的E3连接酶备受关注。该类 E3 连接酶由 Cu13、RING(really interesting new gene)蛋白Rbx1/Roc1/Hrt1 和含有 BTB(bric-a-brac,tramtrack and broad complex)结构域的蛋白质组成。其中,含有BTB结构域的蛋白通过其氨基末端的BTB结构域与Cu13蛋白结合,而通过其羧基末端的结构域如甲基多巴和TRAF同源域(meprin and TRAF homology,MATH)、Kelch 与其底物蛋白质相互结合。生物信息学分析发现人类基因组可编码超过200种含有BTB结构域的蛋白,但大部分成员的功能目前尚不清楚。在含有BTB结构域的蛋白中,有一类被称为KLHL(Kelch like)的蛋白尤为引人关注,该家族蛋白在进化中的高度保守提示它们在细胞中可能具有重要的生理功能。目前,人类基因组组织(Human Genome Organisation,HUGO)已鉴定了 42种KLHL基因,但除了其中少数几种之外,绝大部分成员的功能目前尚不清楚。我们前期通过对美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)基因表达综合库(gene expression omnibus,GEO)的检索发现了 LPS刺激可诱导单核巨噬细胞中KLHL21 mRNA水平的下调(GDS2856,GDS1043,GDS88),提示KLHL21蛋白可能参与了对细胞炎症反应的调控。KLHL21是KLHL蛋白家族的成员,含有一个BTB结构域、一个BACK结构域及5个Kelch重复序列。Sarah Maerki等的研究揭示其在细胞中可通过与Cu13蛋白的结合形成E3泛素连接酶,催化蛋白激酶Aurora B的泛素化修饰,参与调控细胞的有丝分裂。考虑到泛素化修饰在NF-κB的经典激活途径中起着不可或缺的作用,本研究初步探讨了 KLHL21在细胞的炎症反应、特别是NF-κB信号通路中的作用。[研究目的及意义]分析KLHL21在炎症反应、特别是NF-κB信号通路中的作用,并进一步探讨其可能的作用机制,为深入研究KLHL21在炎症反应中的作用及KLHL家族蛋白的功能提供参考依据,也为临床上炎症相关疾病的治疗提供潜在的靶点。[研究方法]1.采用100 ng/ml的LPS刺激小鼠单核巨噬细胞RAW264.7,刺激后不同时间点(0h、0.5h、1h、2h、4h、6h、12h、16h、20h、24h)收集细胞,提取细胞的总RNA并采用荧光实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)技术检测KLHL21 mRNA表达水平的时间依赖性的变化;2.采用100 ng/ml的LPS刺激小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone marrow derived macrophage,BMDM),刺激后不同时间点(0h、1 h、2h、4h、8h、12 h、24 h)收集细胞,提取细胞的总RNA并采用real-time PCR技术检测KLHL21 mRNA表达水平的时间依赖性的变化;3.分别采用 100 ng/ml Pam3CSK4(TLR1/2 激动剂)与 Pam2CSK4(TLR2/6 激动剂)刺激RAW264.7细胞,采用real-time PCR技术检测激活TLR1/2与TLR2/6对KLHL21 mRNA表达水平的影响;4.采用100 ng/ml的LPS刺激小鼠单核巨噬细胞RAW264.7,1 h后再加入5μg/ml放线菌素D抑制细胞内RNA的合成,不同时间点(0 min、30 min、60 min、90 min、120 min)收集细胞并采用real-time PCR技术检测细胞内KLHL21 mRNA表达水平的变化。通过与未采用LPS刺激的RAW264.7细胞进行对比,分析LPS刺激对KLHL21 mRNA稳定性的影响;5.在人胚肾(human embryonic kidney,HEK)293T 细胞中将 KLHL21 分别与肿瘤坏死因子受体相关因子 2(tumor necrosis factor receptor-associated factor-2,TRAF2)、TRAF2、TRAF6、IKKβ(SS/EE)激活型突变体及 p65共表达,采用双荧光素酶报告基因系统分析共表达KLHL21对TRAF2、TRAF6、IKKβ(SS/EE)激活型突变体及p65过表达激活的、在启动子中含κB结合位点的荧光素酶报告基因表达活性的影响;6.在HEK293T细胞中将KLHL21与IKKβ(SS/EE)激活型突变体共表达,采用real-time PCR技术分析共表达KLHL21对IKKβ(SS/EE)激活型突变体诱导的NF-κB下游靶基因NFKBIA、CCL5、TNFAIP3(A20)以及IL-8表达的影响;7.在HEK293T细胞中瞬时表达KLHL21,转染24 h后给予浓度为20 ng/ml的TNFα刺激,不同时间点(0 min、10 min、30 min、60 min)收集细胞,采用核质分离技术分析过表达KLHL21对TNFα刺激诱导的p65核移位的影响;8.在HEK293T细胞中瞬时表达KLHL21,转染24 h后给予浓度为20 ng/ml TNFα 刺激,不同时间点(0 min、15 min、30 min、45 min、60 min)收集细胞并通过Western blotting分析过表达KLHL21对TNFα刺激诱导的IκBα蛋白降解的影响;9.在HEK293T细胞中过表达KLHL21,采用Western blotting分析过表达KLHL21对内源性IκBα蛋白表达水平的影响;10.设计合成了特异性靶向人KLHL21的siRNA,采用RNAiMAX将其转染HEK293T细胞,24 h后给予浓度为20 ng/ml的TNFα刺激,不同时间点(0 min、15 min、30 min、45 min、60 min)收集细胞并通过 Western Bloting 技术分析了抑制KLHL21表达对TNFα刺激诱导的IκBα降解的影响;11.在HEK293T细胞中瞬时表达KLHL21,转染24 h后给予浓度为20 ng/ml TNFα刺激,不同时间点(0 min、5 min、10 min)收集细胞并通过Western blotting分析过表达KLHL21对TNFα刺激诱导的IκBα蛋白磷酸化修饰的影响;12.在 HEK293T 细胞中过表达 KLHL21,采用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,CO-IP)技术分别检测NF-κB信号通路中相关蛋白质IKKα、IKKβ、NEMO、IκBα以及p65与KLHL21蛋白之间的相互结合;13.在HEK293T细胞中过表达KLHL21,采用CO-IP技术检测NEMO与IKKβ的结合是否受KLHL21影响;14.在HEK293T细胞中过表达KLHL21,采用Western blotting技术分析过表达KLHL21后对IKKβ蛋白表达水平的影响。[研究结果]1.采用100 ng/ml LPS分别刺激RAW264.7细胞与BMDM细胞后,real-time PCR检测发现KLHL21 mRNA水平有一个明显的先下降后上升的动态变化过程,在刺激后4h达到最低水平,此时约为正常对照细胞中的10%左右;2.采用100 ng/ml Pam3CSK4与Pam2CSK4分别刺激小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞可诱导KLHL21 mRNA水平出现先下降后上升的动态变化,同样在4 h达最低水平,此时约为正常对照细胞的20%左右;3.与未受刺激的正常细胞对照相比,100 ng/ml LPS刺激1 h可诱导RAW264.7细胞中KLHL2 mRNA稳定性明显下降;4.共表达KLHL21能抑制过表达TRAF2、TRAF6及IKKβ(SS/EE)激活型突变体等诱导的含κB结合位点的荧光素酶报告基因表达活性的上调,但对p65过表达诱导的荧光素酶报告基因表达活性的上调无明显影响;5.过表达KLHL21可抑制IKKβ(SS/EE)激活型突变体诱导的NF-κB下游靶基因的表达CCL5与IκBα,对TNFAIP3的表达没有明显影响,但却可以进一步促进IKKβ(SS/EE)突变体诱导的IL-8的表达上调;6.过表达KLHL21能抑制TNFα刺激诱导的p65的核移位,但却可以促进未受刺激细胞中p65的核移位;7.过表达KLHL21能抑制TNFα刺激诱导的IκBα蛋白的降解,但对内源性IκBα蛋白表达水平无明显影响;8.采用特异性的siRNA抑制HEK293T细胞中KLHL21的表达可促进TNFα刺激诱导的IκBα蛋白的降解;9.过表达KLHL21可抑制TNFα刺激诱导的IκBα蛋白的磷酸化;10.通过免疫共沉淀实验发现KLHL21与NF-κB信号通路上的IKKp蛋白激酶存在相互作用,而与IKKα、NEMO、IκBα及p65没有相互作用;11.采用免疫共沉淀实验分析表明KLHL21与NEMO之间不存在竞争性结合IKKβ的现象;12.过表达KLHL21对内源性IKKβ蛋白的表达水平无影响。[研究结论]KLHL21通过与IKKβ蛋白激酶的相互作用而抑制IκBα蛋白的磷酸化修饰与降解、以及p65(RelA)的移位入核,从而抑制NF-κB信号转导通路的激活,是细胞炎症反应的重要调控因子。