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寄生蜂在与寄主长期协同进化的过程中建立了一套完整的寄生策略用以突破寄主免疫屏障,这是寄生蜂成功寄生的第一步。在不含多分DNA病毒(pol ydnavirus,PDV)的寄生蜂中,毒液被证明能够调控寄主的免疫反应,如黑化反应。免疫反应响应过程中的一些有害中间产物会对机体造成伤害,但丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)能对丝氨酸蛋白酶级联反应起到负反馈调节作用防止免疫过度。在寄生蜂的毒液组分中存在丝氨酸蛋白酶抑制剂及丝氨酸蛋白酶抑制剂类似物,可以调节酚氧化酶原激活因子(prophenoloxidase-activating factor,PPAF)的活性,从而调控寄主酚氧化酶级联反应,最终调节寄主黑化反应。在研究椰扁甲啮小蜂Tetrastichus brontispae毒液组分的过程中,我们发现其毒液中存在一个较高丰度的丝氨酸蛋白酶抑制剂Tbserpin6,因其与寄主水椰八角铁甲Octodonta nipae中的丝氨酸蛋白酶抑制剂Onserpin6结构相似,推测椰扁甲啮小蜂毒液蛋白Tbserpin6在调控寄主免疫反应的过程中具有重要作用。为了验证椰扁甲啮小蜂毒液蛋白Tbserpin6调节寄主水椰八角铁甲酚氧化酶级联反应的功能及其可能的调控机理,本文克隆了椰扁甲啮小蜂毒液蛋白Tbserpin6和水椰八角铁甲Onserpin6、OnPPAF1,并进行体外重组表达验证Tbserpin6、Onserpin6和OnPPAF1在水椰八角铁甲酚氧化酶激活反应中的作用,主要研究结果如下:(1)克隆获得Tbserpin6、Onserpin6和OnPPAF1的全长序列分别为969 bp、1248 bp和1164 bp,分别编码323、416和388个氨基酸。将OnPPAF1的氨基酸序列与其他昆虫的酚氧化酶原激活蛋白酶(PPAF、PPAE和PAP)进行序列比对以及系统进化分析得知,OnPPAF1为trypsin-like丝氨酸蛋白酶具有典型的N-端"clip"结构域以及C-端丝氨酸蛋白酶结构域,属CLIPB族成员,具有酰胺酶活性,能激活酚氧化酶酶原。Tbserpin6与Onserpin6同属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员,两者的反应中心环(RCL)具有较高的相似度,且它们的底物结合位点P1-P1’都是精氨酸和异亮氨酸,推测Tbserpin6与Onserpin6都能够调控水椰八角铁甲的酚氧化酶原的激活反应。(2)利用RNAi技术验证了 OnPPAF1在水椰八角铁甲酚氧化酶反应中的作用。注射dsOnPPAF1至水椰八角铁甲蛹体内后24h,其血淋巴的酚氧化酶活性及黑化反应受到明显抑制,上述结果表明OnPPAF1在水椰八角铁甲的黑化反应中起着重要作用。(3)重组蛋白互作结果表明,Tbserpin6和Onserpin6均能与OnPPAF1互作形成共价复合物。重组蛋白Tbserpin6和Onserpin6能够抑制重组蛋白OnPPAF1的酰胺酶活性,还能抑制水椰八角铁甲蛹血淋巴酚氧化酶活性与黑化反应。综上,OnPPAF1是水椰八角铁甲酚氧化酶反应中的关键酶,Onserpin6与Tbserpin6皆能同OnPPAF1结合进而对该酚氧化酶反应起到负反馈调节作用。椰扁甲啮小蜂调控寄主酚氧化酶级联反应的机理之一可能是该蜂毒液中的Tbserpin6结构与Onserpin6相似,也能与OnPPAF1结合形成共价复合物,进而调控寄主水椰八角铁甲酚氧化酶级联反应。