论文部分内容阅读
研究背景：胃癌是常见的恶性肿瘤之一,在所有恶性肿瘤中排名第四。许多患者被查出胃癌时已处于中晚期,丧失了手术机会。此时,以化疗为主的综合治疗成为首选。近年来多种临床新药的应用,为中、晚期胃癌的临床治疗提供了更多的可能,如5-氟尿嘧啶(5-FU)和顺铂(CDDP)等。然而,化疗药物具有治疗效果的同时亦有副作用,如粒细胞减少,静脉滴注持续时间较长导致的静脉炎、静脉置管并发症等,使胃癌患者依从性差,近年来,中药作为一种辅助治疗性药物越来越受到人们的青眯。牛黄,又名西黄、犀黄。具有清热解毒、抗炎、利胆、抗氧化和清除自由基和增强免疫系统等作用,常用于咽喉肿痛、溃烂、口舌生疮。也可治疗一切痈疽疔毒之症,如用于治疗乳癌、瘰疬、痈毒等症。新近研究发现牛黄具有抑制病毒复制、消炎、利胆、恢复肝功能、提高机体免疫力及抗癌的作用。研究表明：将牛黄作用于人肝母细胞瘤HepG2细胞后,发现其能诱导癌细胞调亡,并可能还有抑制癌细胞生长的作用。这为牛黄在恶性肿瘤的治疗方面的研究和应用开拓了新的思路。迄今,未见牛黄在胃癌中的研究。因此,本研究拟用牛黄干预人胃癌BGC-823细胞株,观察牛黄对BGC-823细胞的抑制增值、诱导凋亡效应,并用牛黄联合5-FU和CDDP诱导BGC-823细胞凋亡的协同作用,以期待为进一步的临床应用提供实验依据。目的：探讨牛黄对BGC-823细胞的增殖抑制、诱导凋亡效应；研究牛黄联合5-FU和CDDP对BGC-823细胞增殖抑制、诱导凋亡的协同作用。方法：用不同浓度的牛黄处理胃癌BGC-823细胞,倒置显微镜下观察细胞形态变化、通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞生长抑制情况,Annexin-V-FIT/PI双染流式细胞术、Hoechst33343染色检测细胞凋亡；单独用一定浓度的牛黄、5-FU.CDDP作用BGC-823细胞,再用一定浓度的牛黄、5-FU和CDDP联合作用BGC-823细胞,通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞生长抑制情况,Annexin-V-FITC/PI双染流式细胞术、Hoechst33343染色、DNA凝胶电泳检测细胞凋亡的情况。结果：1.倒置显微镜下观察发现,BGC-823细胞经不同浓度的牛黄作用24h后细胞数量明显减少、大小不一、细胞间隙增大,表现出明显的细胞生长抑制,随着牛黄浓度的增大和作用时间的延长,细胞形态变圆,体积缩小,折光度减弱,细胞脱落明显,碎片增多。2.MTT法检测不同浓度牛黄作用BGC-823细胞24h、48h、72h后,牛黄各个浓度组的生长抑制率明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)；在同一药物浓度下,随着作用时间的延长,生长抑制率逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05)。MTT法检测牛黄联合5-FU、CDDP对BGC-823细胞的增殖抑制作用,结果发现,BGC-823细胞经5-FU(100μg/mL)加牛黄(400μg/mL)和CDDP(50μg/mL)联合作用48小时后,细胞的生长抑制率为0.471±0.047；而空白对照组和单独使用牛黄、5-FU、CDDP以及5-FU联合CDDP组作用’48小时后,细胞的生长抑制率分别为0±±0、O.243±±0.09、O.25±±0.039、0.258±±0.046、0.366±0.045。各用药组与对照组相比较,差异明显,有统计学意义(P<0.05)；而各单独用药组间相比较,组之间无显著性差异(P>0.05),但联合用药组与各组相比较,差异明显有统计学意义(P<0.05)。5-FU+牛黄+CDDP组与5-FU+CDDP组相比较,差异明显有统计学意义(P<0.05)3.不同浓度牛黄作用BGC-823细胞24h、48h、72h后,流式细胞术分析结果表明100μg/mL牛黄作用后,与对照组比较细胞凋亡率差异不明显(P>0.05),随着药物浓度的增加和作用时间的延长,细胞凋亡率也逐渐增加,差异明显,有统计学意义,其中200μg/mL (P<0.05),400μg/mL、800μg/mL和1200μg/mL组最为明显(P<0.01)。BGC-823细胞经5-FU (100μg/mL)加牛黄(400μg/mL)和CDDP (50μg/mL)联合作用48小时后,细胞的凋亡率为38.98±±2.65；而空白对照组和单独使用5-FU、CDDP以及5-FU联合CDDP组作用48小时后,细胞的凋亡率分别为3.68±0.72、9.344±1.79、12.5±±1.55、26.8士1.86。各用药组与对照组相比较,差异明显,有统计学意义(P<0.05)；联合用药组与各组相比较,差异明显有统计学意义(P<O.05)。5-FU+牛黄+CDDP组与5-FU+CDDP组相比较,差异明显有统计学意义(P<0.05)4. BGC-823细胞经不同浓度的牛黄作用24h后,Hochest33342染色镜下可见,细胞出现核荧光强度增强,细胞核呈波纹状,染色质凝聚浓染,部分细胞核固缩,并有凋亡小体,表现为明亮的蓝染的颗粒。随着药物浓度的升高和作用时间的延长,凋亡细胞逐渐增多,镜下表现为细胞数量逐渐减少。经5-FU(100μg/mL)加牛黄(400g/mL)和CDDP (50μg/mL)联合作用48小时后,这种现象更加明显。5. DNA凝胶电泳结果显示,加牛黄(400μg/mL)、5-FU (100μg/mL)和CDDP (50μg/mL)联合与BGC-823细胞一并培养48小时后,凝胶上出现的DNA条带减弱更为明显。结论：1.体外实验表明,一定浓度的牛黄对人胃癌细胞BGC-823有增殖抑制和诱导凋亡作用。2.一定浓度的5-FU、CDDP单独用药能抑制人胃癌细胞BGC-823增殖。3.牛黄联合5-FU和CDDP对BGC-823有增殖抑制、诱导细胞凋亡的效应,且效应明显高于CDDP、5-FU+CDDP组。