论文部分内容阅读
目的:RNA甲基化修饰作为转录后调控的一种重要形式,对于基因的表达调控具有重要作用。N6-甲基腺苷（m6A）是哺乳动物细胞内mRNA的一种普遍的可逆修饰方式,已证实m6A参与调节mRNA的加工、翻译及衰变。最近研究发现,成年哺乳动物大脑中m6A代表应激后基因表达调控中的一个新窗口,并且m6A表达的失调可能有助于与应激相关的精神疾病的病理生理调节和恢复。但是,m6A甲基化修饰在抑郁症中的作用及潜在机制尚不清楚。基于以上研究背景,本研究主要探究m6A甲基转移酶METTL3在慢性应激（chronic unpredictable stress,CUS）和脂多糖（LPS）诱导小鼠抑郁模型中的变化以及相关分子机制。方法:（1）用CUS及LPS分别诱导小鼠出现抑郁样行为,其是研究抑郁症的动物模型。利用实时定量PCR（qPCR）和蛋白免疫印迹（WB）分别检测CUS及LPS对小鼠内侧前额叶皮质（mPFC）中METTL3和E2F1表达水平的影响,利用皮尔森相关分析来确定METTL3与E2F1 mRNA表达水平的相关性。（2）利用斑点杂交和m6A甲基化定量试剂盒检测CUS及LPS对mPFC中m6A的甲基化水平。（3）通过WB及qPCR确定METTL3过表达对LPS诱导小鼠抑郁模型中mPFC脑区相关突触蛋白及炎性因子表达的影响。（4）通过WB及qPCR检测E2F1敲减对LPS诱导小鼠抑郁模型中mPFC脑区相关突触蛋白及炎性因子表达的影响。（5）通过生信分析及RNA甲基化免疫沉淀（m6A-RIP）确定E2F1是否包含m6A甲基化修饰位点。（6）利用体外转染siRNA或shRNA,分别研究降低内源性METTL3对E2F1表达的影响。（7）通过斑点杂交、m6A-RIP及荧光素酶报告基因确定E2F1是否是METTL3催化的底物。（8）通过体外转染及免疫荧光染色,探讨METTL3及YTHDF2调控E2F1表达的相关分子机制。（9）利用ChIP-qPCR确定METTL3及E2F1调控炎性因子表达的机制。（10）通过用慢病毒体外感染细胞来过表达METTL3或敲减内源性E2F1表达水平,研究METTL3/E2F1通路对体外LPS诱导的细胞炎性因子表达水平的影响。结果:（1）CUS和LPS分别诱导小鼠出现抑郁样行为;CUS和LPS分别导致小鼠mPFC中METTL3表达水平降低,而E2F1表达水平升高,二者呈负相关。（2）CUS和LPS分别诱导小鼠mPFC中m6A甲基化水平显著降低。（3）过表达METTL3有效逆转了 LPS诱导的NMDA受体以及炎性因子表达水平的增加。（4）减少内源性E2F1表达水平可以抑制LPS诱导的NMDA受体及炎性因子表达水平的增加。（5）E2F1 mRNA存在潜在m6A甲基化修饰位点。（6）体外敲减METTL3的表达水平上调E2F1的表达水平。（7）E2F1是m6A甲基转移酶METTL3催化的底物。（8）METTL3通过依赖YTHDF2在转录后降低E2F1的表达。（9）E2F1作为转录因子促进炎性因子的表达。（10）体外METTL3/E2F1通路抑制LPS诱导的炎性因子的表达。结论:（1）CUS和LPS分别诱导小鼠出现抑郁样行为。（2）CUS和LPS分别导致小鼠mPFC中METTL3表达水平降低,E2F1表达水平升高,二者呈负相关。（3）CUS和LPS分别引起小鼠mPFC脑区中m6A甲基化水平下降。（4）E2F1是METTL3的下游信号分子。（5）METTL3/E2F1通路通过抑制炎症因子调节NMDA受体的表达量。（6）METTL3通过YTHDF2蛋白转录后沉默E2F1的表达。（7）METTL3/E2F1/炎性因子可能在LPS诱导小鼠抑郁样行为发生中发挥重要的调节作用。