第一部分 MXR7在肝癌中甲基化的研究 目的—前期研究表明MXR7／GPC3基因在肝癌组织较癌旁组织中表达明显增高，而在正常肝组织中表达沉默。另发现该基因在多种肝癌细胞系中表达，但在其它21种非肝癌肿瘤细胞系中基本不表达。此外，MXR7基因在其它实质性肿瘤中也均未见表达，这提示了该基因是肝癌内高表达的较为特异性的标志基因。但是，到目前为止MXR7基因在肝癌中的重新开放的机制仍不甚清楚。由于该基因的第一外显子内含有1个CpG岛，而且经大量实验表明CpG岛的甲基化与基因表达调控以及肿瘤的发生发展有着密切的关系，本课题对MXR7基因在肝癌中甲基化状态与该基因重新开放的关系进行初步研究，为深入阐明MXR7基因在肝癌中重新开放的机理以及对肝癌发病机制提供实验依据，并且为进一步研究肝癌早期诊断标志物以及对肝癌的早期防治打下理论基础。方法—采用甲基化检测的常用方法。用EcoRI和甲基化敏感限制性内切酶EagI对20对肝癌组织及其相应的癌旁组织、2例血管瘤组织以及2种细胞（MCF-7、HepG2）的基因组DNA进行单双酶切反应，并且针对MXR7基因特定甲基化位点设计一对引物，制备标记α-³²p-dCTP的探针。最后，通过Southern blot方法检测不同肝癌组织及其相应癌旁组织中MXR7基因的甲基化状态。结果与讨论—研究发现在20对肝癌与癌旁组织中，有18例肝癌组织中的MXR7基因都呈现非甲基化状态。而与其相应的癌旁组织中，MXR7基因也均为非甲基化状态。其中2对女性患者的肝癌组织中的MXR7基因为部分甲基化状态。此外，MXR7基因在2例肝血管瘤组织以及肝癌细胞系HepG2中也为非甲基化状态。这些结果与Hsingchi Lin等研究的卵巢癌细胞系中MXR7基因甲基化状态不同。在卵巢癌细胞系中，MXR7基因表达沉默，发现它是处于高甲基化状态。Hsingchi Lin等得出结论是MXR7基因的表达沉默与该基因的高甲基化有关，籍此，不能排除在肝癌中MXR7基因呈现的非甲基化状态可能与该基因在肝癌中高表达有关。然而，在正常肝组织中MXR7基因非甲基化状态与肝癌组织类似，这一结果与正常肝组织2001级硕士学位论文中文摘要中MXR7基因高甲基化的推论有差异，提示MXR7基因的非甲基化状态与该基因在肝癌中高表达可能没有直接的关系。 第二部分MXR7特异性多克隆抗体协同化疗药物对肝癌细胞杀伤作用的研究 目的一临床上常使用化疗药物作为肝癌治疗的方法之一，但是使用过高浓度的化疗药物会导致患者诸多不良反应，甚至会对患者的身体造成严重危害。因此，寻求既能增强化疗药物功效同时又能减少其副作用的辅助物己成为人们极其关注的问题。我们将MXR7多克隆抗体协同最常用的二种化疗药物丝裂霉素C（MMC）和5一氟尿嗜睫（5一FU）作用于肝癌细胞（HepGZ和Huh7），观察它们协同作用后对肝癌细胞的杀伤程度，从而获得在不同天数中最适MXR7多克隆抗体和相应化疗药物的浓度，为临床用药提供实验资料。方法一将培养的肝癌细胞系HepoZ和Huh7按常规方法（5.oxlo4个/ml、Zxlo6个/ml）分别接种于96孔板中。设定不同浓度的MXR7特异性多克隆抗体（0雌/ml;0.01雌/ml; 0.1陀/ml;l拼g/ml;10林g/ml）、MMC（0抖g/ml;10拜g/inl:20林g加1）和5一FU（0林g/ml;10抖g/ml;100雌/ml），并设实验组孔和对照组孔，每种浓度设六个复孔，加入培养。采用四氮甲哇蓝（MTT）法依据不同的培养天数检测细胞的存活率，分析得出MXR7多克隆抗体和化疗药物的最适浓度以及相应的天数。结果和讨论一MXR7特异性多克隆抗体协同MMC作用HePGZ细胞后，发现第一天、第二天和第四天的协同杀伤HePGZ细胞作用不显著（P>0.05）;而第三天和第五天，0.1林g/ml MXR7多克隆抗体协同10林g/m 1 MMC杀伤HePGZ细胞作用显著（P<0.05）。此外，MXR7多克隆抗体协同5一FU作用Huh7后发现，同样在第一天，MXR7多克隆抗体协同5一FU杀伤细胞作用不显著（P<0.05）;而在第三天，0.1协 g/ml MXR7多克隆抗体协同10林g/m 15一FU后，杀伤细胞生长作用显著（P<0 .05）。MXR7在肝癌中呈高表达并对肝癌细胞增殖有一定的促进作用，研究发现MXR7多克隆抗体在某一浓度协同化疗药物对肝癌细胞的生长有一定的杀伤作用。MXR7通过GPI锚定在细胞膜上，接受的细胞外信号再通过GPI锚转导至细胞内，启动细胞内信号转导机制，提示MXR7多抗协同化疗药物杀伤肝癌细胞的作用可能与MXR7参与信号通路有关。本部分的研究内容只是对MXR7多抗协同化疗药物杀伤肝癌细胞进行的初步实验，提示一定浓度的MXR7多抗协同较低浓度的化疗药物对2001级硕士学位论文中文摘要肝癌细胞可能有杀伤作用。