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背景和目的:糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)是终末期肾脏病(end-stage renal disease,ESRD)的主要原因之一。研究发现,DN发生发展的过程中炎症免疫反应起着重要作用。巨噬细胞是一种常见的免疫炎性细胞,其浸润活化可作为DN发生发展的关键环节。巨噬细胞激活后可以释放炎症介质损伤细胞和组织,但是否还有其它机制会加重肾损伤,近年来引起极大关注。DN的发病机制包括炎症、纤维化等,如何诱导炎症的发生,通过何种通路,是我们需要关注的问题。Bruton酪氨酸激酶(Bruton’s tyrosine kinase,BTK),是非受体酪氨酸激酶Tec家族中的一员,其参与介导人类、动物体内不同信号通路,在细胞的增殖、分化和凋亡中起到十分重要的作用。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)炎症小体包括NLRP3、凋亡相关点样蛋白包含caspase募集域(Apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain,ASC)及半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-1(cysteine aspartic acid specific protease-1,caspase-1),NLRP3募集ASC,进而活化caspase-1前体。近期有研究表明,NLRP3可单独或协调BTK加重炎症反应。在本实验中,我们将从DN患者、BTK敲基因小鼠以及骨髓来源巨噬细胞(Bone marrow-derived macrophages,BMMs)三个层面对BTK介导下的NLRP3炎症小体如何调节DN炎症反应及其作用机制进行探讨,为DN治疗提供新的方向和策略。方法:第一部分:2型糖尿病肾病患者肾脏内巨噬细胞激活及NLRP3炎症小体的激活收集2017年1月到2019年12月于安徽医科大学第一附属医院肾内科行肾穿刺活检,并通过病理学检查确诊为糖尿病肾病的患者共16例,并对患者的临床资料进行统计。同期收集我院泌尿外科肾脏肿瘤术后病变旁2cm以上肾组织作为对照组共10例,收集我院体检中心正常体检对象的清晨空腹血作为对照组共10例。留取糖尿病肾病患者(DN组)及对照组(Control组)的血清标本,ELISA法测定血清中炎症因子白介细胞素-1β(Interleukin-1β,IL-1β),肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)和单核细胞趋化蛋白-1(Monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)水平。免疫组化检测DN组及Control组(来源于癌旁正常肾组织)肾组织中CD68和BTK的表达。免疫荧光检测DN组及Control组中CD68与诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)、BTK、p-BTK、NLRP3共表达的情况。第二部分:Bruton酪氨酸激酶基因敲除及抑制剂应用对高糖刺激下的巨噬细胞炎症小体激活的影响提取小鼠骨髓来源原代巨噬细胞(BMMs),F4/80与CD11b标记细胞,流式细胞术鉴定细胞纯度。CCK-8法检测BTK抑制剂PCI-32765在不同浓度梯度下对BMMs活性的影响;蛋白免疫印迹法(Western blot,WB)检测各组中p-BTK与BTK蛋白表达变化,选取药物最适浓度;设置不同的时间梯度,检测高糖(high glucose,HG)刺激下不同时间点NLRP3、ASC及caspase-1蛋白表达变化,选取最适刺激时间。巨噬细胞分组为:C组(含5.5 mmol/L glucose),M组(含24.5 mmol/L甘露醇+5.5 mmol/L glucose),C+PCI组(5.5 mmol/L glucose+PCI-32765),HG组(含30 mmol/L glucose),HG+PCI组(30 mmol/L glucose+PCI-32765),BTK-/-组(BTK基因敲除低糖组),HG+BTK-/-组(BTK基因敲除高糖组)。Transwell实验观察各组BMMs的趋化功能变化;ELISA检测各组BMMs培养基上清液中炎症因子IL-1β和MCP-1水平变化;实时定量PCR检测各组BMMs中IL-1β,TNF-α和MCP-1 mRNA表达水平变化;激光共聚焦检测各组BMMs中M1型极化标志物i NOS表达变化及炎症小体蛋白NLRP3表达变化;免疫荧光共标及免疫共沉淀验证各组BMMs中NLRP3和ASC相互结合作用。Western blot实验检测各组BMMs炎症小体相关蛋白NLRP3、ASC及caspase-1的表达。第三部分:Bruton酪氨酸激酶基因敲除通过减少NLRP3炎症小体激活对糖尿病小鼠肾组织损伤的保护作用及机制探讨动物分组为野生C57BL/6J小鼠组(WT),糖尿病模型组(STZ),BTK敲基因对照组(BTK-/-),BTK敲基因糖尿病模型组(BTK-/-+STZ),每组8只。造模方法为通过小鼠腹腔注射链脲佐菌素(Streptozocin,STZ),每只小鼠剂量为50 mg/kg,对照组注射相同体积的枸橼酸钠溶液,5天内进行连续注射,1周后检测随机血糖,血糖值≥16.7 mmol/L视为造模成功。小鼠常规饲养12周后收集各组小鼠血液、尿液及肾脏组织标本,测定肾重与体重之比、血糖及24小时尿白蛋白排泄率。PAS染色观察各组小鼠肾组织病理变化情况;免疫组化染色观察各组小鼠肾组织中巨噬细胞标志物F4/80、足细胞标志物WT1及Nephrin表达变化;透射电镜观察各组小鼠肾组织的超微结构,包括足细胞、足突、系膜区及基底膜的病变程度,同时测定基底膜厚度变化;Western blot检测各组小鼠肾组织中p-BTK、BTK及炎症因子IL-1β,TNF-α以及MCP-1的蛋白表达变化;实时定量PCR法检测各组小鼠肾组织中IL-1β,TNF-α和MCP-1 mRNA水平表达变化;Western blot检测各组小鼠肾组织中NLRP3、ASC及caspase-1的蛋白表达变化。结果:第一部分:2型糖尿病肾病患者肾脏内巨噬细胞激活及NLRP3炎症小体的激活ELISA结果提示,DN组血清中炎症因子IL-1β,TNF-α及MCP-1较Control组明显升高(P<0.05);免疫组化结果提示,DN组巨噬细胞标志物CD68和BTK表达增多(P<0.05);激光共聚焦结果提示,DN组巨噬细胞中i NOS、BTK、p-BTK、NLRP3较Control组表达明显增多(P<0.05)。DN患者血清中炎性因子水平升高,炎性介质可以将巨噬细胞招募进入肾脏,肾脏内巨噬细胞浸润增加。同时,肾脏巨噬细胞激活及BTK,NLRP3的活化均明显增加。第二部分:Bruton酪氨酸激酶基因敲除及抑制剂应用对高糖刺激下的巨噬细胞炎症小体激活的影响流式细胞术结果显示F4/80和CD11b双阳性的细胞占总细胞数的93.88%,符合实验需求下的纯度以及成熟度。实验条件优化:CCK-8结果显示抑制剂浓度在10-8到10-5 mmol/L时对细胞活性没有影响,Western blot结果显示最佳抑制剂浓度为10-6 mmol/L,最佳高糖刺激时间为12 h。Transwell结果表明高糖刺激下巨噬细胞细胞的趋化功能增加,而HG+BTK-/-组和HG+PCI-32765组细胞迁移能力较HG组明显减弱。ELISA结果显示HG组细胞培养基上清液中炎症因子MCP-1、TNF-α及IL-1β较C组明显升高(P<0.05),C组与M组无明显差异(P>0.05),HG+BTK-/-组和HG+PCI-32765组较HG组明显下降(P<0.05)。PCR结果显示HG组MCP-1、TNF-α及IL-1β的mRNA水平表达较C组明显上升(P<0.05),而HG+BTK-/-组和HG+PCI-32765组较HG组则明显下降(P<0.05)。激光共聚焦结果提示HG组iNOS表达较C组明显上升(P<0.05),而在HG+BTK-/-组和HG+PCI-32765组明显下降(P<0.05),同时免疫荧光结果提示NLRP3炎症小体活化在HG组较C组明显增多(P<0.05),而在HG+BTK-/-组和HG+PCI-32765组明显减少(P<0.05)。激光共聚焦结果提示NLRP3和ASC在细胞内表达位置一致,并且HG组表达较C组上升(P<0.05),而HG+BTK-/-组和HG+PCI-32765组表达较HG组下降(P<0.05)。免疫共沉淀结果显示NLRP3可以与ASC发生共作用。Western blot结果显示HG组中NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1p20蛋白表达较C组明显上升(P<0.05),而HG+BTK-/-组和HG+PCI-32765组表达较HG组下降(P<0.05)。第三部分:Bruton酪氨酸激酶基因敲除通过减少NLRP3炎症小体激活对糖尿病小鼠肾组织损伤的保护作用及机制探讨STZ组小鼠血糖、肾体比及24小时尿蛋白排泄率较WT组有显著升高(P<0.05);BTK-/-+STZ组小鼠相关指标较STZ组有下降(P<0.05)。PAS染色结果显示STZ组小鼠系膜扩张以及肾小管间质损伤较WT组增加,系膜扩张指数增加(P<0.05),BTK-/-+STZ组的病理改变则得到明显缓解(P<0.05)。免疫组化结果提示STZ组较WT组中F4/80表达增加,足细胞标志物WT1及Nephrine表达减少,有统计学差异(P<0.05),而BTK-/-+STZ组较STZ组中F4/80表达减少,WT1及Nephrine表达增加,差异有统计学差异(P<0.05)。电镜结果提示与WT组相比,STZ组基底膜厚度增宽(P<0.05),系膜细胞及基质增生,足突部分融合,足细胞数量减少,而BTK-/-+STZ组基底膜厚度较STZ组变薄(P<0.05),系膜细胞及基质增生减少,足细胞数量增加,足突融合减轻。蛋白免疫印迹提示BTK,p-BTK,i NOS及炎症因子IL-1β,TNF-α,MCP-1蛋白表达量在STZ组较WT组明显增多(P<0.05),而经BTK基因敲除后表达下降(P<0.05)。实时定量PCR结果显示肾组织炎症因子TNF-α,MCP-1,IL-1βmRNA表达在STZ组较WT组明显升高(P<0.05),而经BTK基因敲除后表达量明显降低(P<0.05)。Western blot显示炎症小体相关蛋白NLRP3、ASC与caspase-1相对表达量STZ组较WT组明显上升(P<0.05),而在BTK基因敲除后表达量明显下降(P<0.05)。结论:1、2型糖尿病肾病患者血清中炎症因子升高,肾组织内巨噬细胞浸润增加且BTK表达增多,进一步研究发现巨噬细胞内i NOS、BTK、p-BTK和NLRP3表达增多,提示DN患者处于微循环炎症状态,肾组织内巨噬细胞浸润增加,炎症小体激活增加。2、高糖可以刺激巨噬细胞活化,并且炎症因子TNF-α、MCP-1及IL-1β的表达明显上升。在作用机制方面,高糖可以增加巨噬细胞中p-BTK,NLRP3,ASC和caspase-1的蛋白表达,而BTK抑制和敲除后炎症减轻,炎症小体信号通路相关蛋白表达量降低,提示BTK可以通过NLRP3-ASC-caspase1轴调控巨噬细胞的炎症作用。3、糖尿病小鼠尿蛋白排泄增加,肾组织中p-BTK、i NOS、NLRP3、ASC、caspase1、IL-1β、TNF-α,MCP-1的蛋白表达较对照组明显上升,并且炎症因子的mRNA相对表达量增加。而经BTK基因敲除后,小鼠尿蛋白减少,肾组织内巨噬细胞浸润及足细胞损伤减少,肾组织内炎症减轻,提示BTK可能参与了糖尿病小鼠肾组织的炎症作用。进一步研究发现,肾组织内NLRP3,ASC和caspase1的蛋白表达下降,这说明BTK可以通过NLRP3-ASC-caspase1轴来介导糖尿病小鼠的肾组织内的炎症,并且BTK敲除后可以减轻小鼠糖尿病肾损伤。