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第一部分RBP4蛋白试剂盒的构建与性能评估目的:建立血清RBP4蛋白ELISA试剂盒检测方法,并按照《体外诊断试剂分析性能评估指导原则》的标准对其进行性能评估,构建出符合体外诊断试剂盒标准的血清RBP4 ELISA检测试剂盒,为临床诊断和人群流行病学筛查提供辅助检测方法。方法:1.对RBP4组合式ELISA试剂盒的检测方法进行反应条件最优化的探讨;以P/N值最大作为判断标准确定最优捕获抗体的包被温度、时间（37℃2 h、25℃过夜、4℃过夜）;采用棋盘方阵滴定法,将anti-RBP4捕获抗体浓度和anti-RBP4检测抗体进行优化,根据P值接近1,N值接近0.2,且P/N值最大的筛选标准确定其最佳工作浓度。2.以P/N值最大作为判断标准确定最优检测抗体的孵育时间（1 h、1.5h、2 h）;采用棋盘方阵滴定法,以P/N值最大作为判断标准确定HRP工作浓度和时间的最优化;以P/N值最大判断最优化TMB底物显色时间。3.按已优化的RBP4组合式试剂盒条件下,根据标准曲线是否存在“钩状效应”及拟合优度值来确定标准曲线。4.按照《体外诊断试剂分析性能评估指导原则》的标准对建立的RBP4蛋白ELISA试剂盒进行性能评估,灵敏度评估通过求其（X+2S）得出;精密度评估:求其批内变异系数和批间变异系数求得。5.准确度评估:通过加入不同浓度标准品到待测样本中,制备回收样本,求其回收率;干扰物评估:通过加入不同浓度血红蛋白、维生素C干扰物到待测样本中,评估其对样本检测的干扰性;稳定性评估:通过比较新配制的试剂盒和稳定性期末两组之间的一致性（配t检验法）来判断;最后对22例的正常和肝癌患者血清RBP4水平进行检测。结果:1.选取OD450nm值为1.06的150 pg/m L的RBP4蛋白标准品为标准阳性参考品P,以稀释液作为标准阴性参考品N。2.4℃过夜包被条件作为捕获抗体包被的最佳条件;捕获抗体与检测抗体反应浓度分别为2μg/m L、0.25μg/m L。3.其检测抗体孵育时间为1 h;根据棋盘法确定HRP工作浓度和时间,HRP标记链霉亲和素稀释度为1:150,孵育时间为20 min;底物显色液孵育时间为15 min;综合以上优化的条件,最后确定标准曲线的检测范围为1500pg/m L～23.44 pg/m L,拟合优度>0.999。4.灵敏度评估:RBP4 ELISA试剂盒灵敏度为16.58 pg/m L;精密度评估:批内变异系数在1.41%～5.42%之间,批间变异系数在2.45%～5.08%之间。5.准确性评估:结果显示平均回收率在99.34%～100.32%之间,比例系统误差为0.32%～0.66%之间,均不大于5%;干扰性评估:干扰物维生素C的干扰效果在0.99%～3.50%范围内,血红蛋白的干扰效果在-4.27%～-1.53%范围内,两种干扰物质的干扰效果均≤±10%。6.稳定性评估:结果显示两组之间均一致性良好（P>0.05）,稳定性无差异;检测正常对照、肝癌患者血清RBP4的水平分别为43.42（37.72,53.16）μg/m L、23.05（18.47,41.19）μg/m L,肝癌患者血清RBP4的水平明显降低（p<0.05）。结论:1.本研究成功构建血清RBP4蛋白ELISA检测盒。2.构建的血清RBP4蛋白ELISA试剂盒具有较高灵敏度、精密度、准确度,抗干扰性较强,稳定性好;且各项指标均能达到申请体外诊断试剂盒要求。3.构建的血清RBP4蛋白ELISA试剂盒可用于血清RBP4蛋白水平的检测。第二部分RBP4蛋白表达及单克隆抗体制备目的:通过大肠杆菌表达系统表达RBP4重组蛋白,对蛋白表达条件进行优化并纯化RBP4蛋白。以RBP4重组蛋白作为免疫原制备RBP4单克隆抗体,并对其亲和力、特异性进行鉴定。方法:1.用RT-PCR法体外扩增RBP4基因片段,将RBP4基因和p ET30a质粒经双酶切后,连接构建p ET30a-RBP4重组载体;最后挑取菌液PCR和双酶切验证阳性的单克隆菌送测序验证p ET30a-RBP4载体。2.利用大肠杆菌BL21诱导蛋白表达,分析蛋白表达形式;分别于不同诱导温度诱导4 h,确定最适诱导温度;根据最适诱导温度加入不同浓度的IPTG诱导剂,确定最适IPTG浓度。3.采用不同的咪唑浓度洗脱重组蛋白以确定Ni柱的最适咪唑浓度;经Ni柱法初步纯化,结合KCl负染切胶回收法,获得高纯度的RBP4重组蛋白;通过Western blot对RBP4重组蛋白进行鉴定。4.以RBP4重组蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,经间接法ELISA检测小鼠血清效价,当小鼠血清效价大于1:10000时,进行细胞融合;通过间接法ELISA筛选出阳性杂交瘤细胞,经有限稀释法对阳性杂交瘤细胞亚克隆,获得单克隆阳性杂交瘤细胞。5.通过腹水诱生法对RBP4单克隆抗体进行大量制备;将腹水经rProtein G柱纯化获得RBP4单克隆抗体;经Sigma试剂盒检测RBP4单克隆抗体亚型;利用间接法ELISA测定单克隆抗体亲和力常数。6.间接法ELISA和Western blot进行RBP4单克隆抗体特异性鉴定。结果:1.在约600 bp处出现与预期的RBP4目的基因长度相符的单一条带;测序结果与RBP4目的基因序列一致,表明成功构建p ET30a-RBP4重组载体。2.RBP4重组蛋白以沉淀包涵体的形式存在;大肠杆菌在28℃、1.0 mM IPTG诱导条件下可大量诱导RBP4重组蛋白表达。3.Ni柱的最适咪唑洗脱浓度为150 mM;经二次纯化后,可获得纯度达到96%以上的RBP4重组蛋白;经Western blot结果表明,在29 k D处有明显的蛋白条带,表明表达的重组蛋白为RBP4重组蛋白。4.经间接法ELISA检测小鼠的血清效价为1:729000,达到细胞融合的标准;通过三次亚克隆筛选,获得5株（1D2、1G2、2F4、10G2、10B10）能够稳定分泌RBP4单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞,腹水效价均大于1:2187000;单克隆抗体的亚类鉴定结果显示均为Ig G的亚型。5.经间接法ELISA测得RBP4单克隆抗体亲和力常数为3.98×10~8L/mol,属于高亲和力型抗体;特异性鉴定显示制备的RBP4单克隆抗体仅与肝癌细胞Hep3B、Huh7表达的天然RBP4蛋白、重组RBP4蛋白、RBP4蛋白标准品（R＆D公司）特异性结合,而与SHBG-His重组蛋白、重组SAA4-His蛋白、重组NEK2-His蛋白以及BSA白蛋白无交叉反应。结论:1.成功构建pET30a-RBP4重组载体,大肠杆菌诱导的RBP4重组蛋白以沉淀包涵体形式表达,经二次纯化后,可获得高纯度的RBP4重组蛋白。2.高纯度的RBP4重组蛋白可以获得高效价血清抗体,制备的RBP4单克隆抗体属于稳定性较强的Ig G亚型,其高效价、高亲和力、特异性强的特征,可应用于RBP4 ELISA检测试剂盒的构建,为自主研发构建RBP4ELISA检测试剂盒奠定基础。