【摘 要】
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[目的]:用酵母双杂交共转染和配合技术筛选经纯化鉴定的已知人胰腺cDNA文库与丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)核心蛋白(core)相互作用的蛋白的编码基因,为研究HCVcore蛋白基因在HCV感染所致MS中的作用提供了实验依据。[方法]:常规扩增人类胰腺cDNA文库并纯化、鉴定。通过多聚酶链反应(PCR)法扩增HCVcore基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质
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[目的]:用酵母双杂交共转染和配合技术筛选经纯化鉴定的已知人胰腺cDNA文库与丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)核心蛋白(core)相互作用的蛋白的编码基因,为研究HCVcore蛋白基因在HCV感染所致MS中的作用提供了实验依据。[方法]:常规扩增人类胰腺cDNA文库并纯化、鉴定。通过多聚酶链反应(PCR)法扩增HCVcore基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒“pGBKT7—core”。首先应用共转染技术,把诱饵质粒与文库质粒共同转染酵母细胞AH109,在四缺培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)和铺有X-α-gal的四缺培养基上进行双重阳性菌落筛选,提取蓝色酵母菌落质粒,电转化大肠埃希菌DH5α后再提取质粒测序,进行生物信息学分析。然后本研究又应用了配合技术,将文库质粒转染酵母细胞Y187,在亮氨酸缺陷型培养基(SD/-Leu)上筛选阳性菌落。pGBKT7-core转染酵母细胞AH109,在色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp)上筛选阳性菌落。将两种酵母细胞进行配合,同样也要在四缺培养基和铺有X-α-gal的四缺培养基上进行筛选,提取阳性酵母菌落质粒,电转化大肠埃希菌DH5α后再提取质粒测序,测序结果进行生物信息学分析。[结果]:得到预转化的人胰腺cDNA文库,其滴度为4×107,纯化后的文库质粒浓度约为0.34mg/ml。用EcoRⅠ,X hoⅠ双酶切鉴定cDNA文库的多样性,结果显示插入片断大小不一。用共转染技术,筛选出6种与HCVcore蛋白结合蛋白基因,包括人类胰蛋白酶1,人类羧肽酶A1,人类胰凝乳蛋白C,人类富含赖氨酸卷曲螺旋1,人类锌指基质蛋白1,人类未知特征的骨髓蛋白BM044。用配合技术,筛选出11种与HCVcore蛋白相结合蛋白基因,包括人类辅脂肪酶、人类驱动蛋白家族3B、人类羧肽酶B1、人类线粒体蛋白基因、人类胰蛋白酶1、人类胰蛋白酶2等。[结论]:本研究用酵母双杂交共转染和配合技术筛选人胰腺cDNA文库,分别获得6种和11种与HCVcore蛋白相结合蛋白基因。该结果为进一步探讨HCV感染导致MS提供了新思路,而且还证实了配合技术优于共转染技术,说明了酵母双杂交系统的进步和发展。
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