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背景与目的角膜新生血管(corneal neovascularization, CNV)是角膜外伤、感染后最常见的并发症,不但严重影响视力,也是角膜移植术后发生排斥反应的高危因素。血管内皮细胞的迁移与增殖是CNV形成的关键步骤。ADP-核糖基化因子(ADP-ribosylation factor, ARF)是小G蛋白Ras超家族的成员,它们是一类大小约20kDa的鸟嘌呤核苷酸(GTP)结合蛋白,主要功能是参与细胞内物质运输和信号转导过程。以往关于ARF的功能研究主要集中在肿瘤方面,发现ARF蛋白是肿瘤细胞增殖和代谢的调控分子。近来有研究表明ARF在血管内皮细胞的迁移及管腔形成中起重要作用,然而关于ARF在CNV中的作用及其机制国内外尚未见报道。因此,本课题应用小鼠碱烧伤诱导CNV模型并予ARF抑制剂干预,利用角膜铺片免疫荧光组织化学法观察抑制ARF对碱烧伤诱导CNV的影响,通过RT-PCR法及体外实验细胞干预后行流式细胞技术检测细胞凋亡率来探讨ARF在碱烧伤CNV形成中的作用与机制。材料与方法1、20只BALB/c小鼠做左眼碱烧伤诱导CNV模型,于碱烧伤后0d、7d、14d、21d各时间点随机取5只小鼠处死,取角膜以RT-PCR法检测各时间点ARF mRNA的表达情况。2、21只BALB/c小鼠做左眼碱烧伤诱导CNV模型,于一周后将其随机分成25μg/mlARF抑制剂干预组(11只)和0.2%透明质酸钠(sodium hyaluronate, HA)对照组(10只)予局部点眼,每日3次,持续2w。干预两周后观察各组CNV并拍照,处死所有小鼠,取眼球行角膜铺片以备免疫组织化学荧光标记法检测其角膜组织中CD31表达并对角膜新生血管面积进行比较,分析ARF抑制剂对碱烧伤CNV的作用。3、20只BALB/c小鼠碱烧伤一周后将其随机分为实验组与对照组,每组10只,分别给予25μg/mlARF抑制剂或0.2%HA局部点眼,每日3次。在碱烧伤后2w和3w分别从各组中随机取5只小鼠处死,取角膜以RT-CR法检测角膜组织中Caspase-3及VEGF mRNA的表达情况,并比较两组之间的差异。4、体外实验：采用人视网膜血管内皮细胞(Human retinal endothelial cells, HRECs)为研究对象,用含或者不含14μM ARF抑制剂的培养液处理对数生长期的HRECs24h作为实验组或对照组,然后以Annexin V-FITC/PI双染色法后流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果1、正常小鼠角膜组织中ARF mRNA微量表达,而碱烧伤后第7d、14d、21d小鼠角膜组织中ARF mRNA表达明显增高,于碱烧伤后14d达高峰。2、碱烧伤后3w, ARF抑制剂实验组CNV形成较对照组明显减少(P<0.05)。3、碱烧伤后2w、3w,ARF抑制剂实验组角膜组织中凋亡相关因子Caspase-3表达较对照组明显增高(P<0.05),而VEGF基因表达较对照组明显减少(P<0.05)。4、体外实验：ARF抑制剂实验组细胞凋亡率较对照组明显增高(P<0.05)。结论1、ARF mRNA在碱烧伤后角膜组织中有表达,于第14d达高峰。2、ARF抑制剂能促进碱烧伤CNV的退化。3、ARF抑制剂促进碱烧伤CNV的退化,可能与其上调碱烧伤后角膜组织中凋亡相关因子Caspase-3和下调VEGF的表达有关。4、ARF抑制剂促进血管内皮细胞凋亡。