论文部分内容阅读
丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）是我国传统中药，具有活血化瘀、通经活络之功效。现代医学研究发现以迷迭香酸（RA）和丹酚酸B（SAB）为代表的水溶性酚酸类成分被认为是丹参发挥药效的活性物质基础的重要部分，逐渐受到研究人员的关注。但目前对于丹参水溶性酚酸类生源途径的研究还刚刚起步，尤其是丹参中标志性酚酸类成分丹酚酸B的代谢途径还未见相关报道。同时对于丹参中已有报道的另一标志性成分迷迭香酸的生源途径研究还不够全面，其下游的关键酶基因SmRAS、SmCYP98A14并未有相关研究。因此针对这些问题的研究对于丹参中酚酸类资源的开发利用具有重要意义。本研究利用13C同位素标记前体饲喂的方法，对丹参酚酸类化合物尤其是丹酚酸Ｂ的生源途径进行了探索，并利用动态监测的方法对已报道的迷迭香酸的生源途径进行了重新评价。同时，克隆得到了酚酸类生源途径上的3个重要基因SmRAS、SmCYP98A14、SmCPR，并对这3个基因的功能进行了研究。我们得到了如下结果：1、首次通过同位素标记提出了迷迭香酸到丹参酚酸B可能的生物合成过程，两分子迷迭香酸经过催化生成丹酚酸E，丹酚酸E环合生成丹酚酸B。这是首次对丹参酚酸B的生源途径进行探索，为解决丹参酚酸类化合物生物合成的这一重要问题提供了有价值的信息。2、利用同位素标记动态监测的方法对迷迭香酸生源途径进行了重新评估。结果显示，丹参中迷迭香酸生物合成的主要以咖啡酰CoA和4-羟基苯乳酸生成咖啡酰-4-羟基本乳酸，而后在SmCYP98A14的催化下生成迷迭香酸为主，而非之前报道的4-香豆酰CoA与4-羟基苯乳酸反应生成4-香豆酰-3-4-羟基苯乳酸，而后在SmCYP98A14的催化下生成迷迭香酸。这个结论改变了我们之前对迷迭香酸生物合成过程的认识，对重新认识迷迭香酸生物合成有重要价值。3、在以上研究基础上，首次将迷迭香酸与丹酚酸Ｂ的生物合成的过程联系到一起，描述了从苯丙氨酸和酪氨酸开始经迷迭香酸最终生成丹酚酸B的整个过程，极大拓展了丹参酚酸类化合物的生源途径，帮助人们重新认识酚酸类化合物的生物合成过程。4、克隆得到了丹参酚酸类生源途径上的关键酶基因SmRAS（Genbank accessionNo. ADA60182）包含1489bp碱基，其中包括1284bp的开放阅读框（ORF）编码428个氨基酸、SmCYP98A14（Genbank accession No. HQ316179）包含1714bp碱基，其中包括1527bp的开放阅读框（ORF）编码508个氨基酸、SmCPR（Genbank accessionNo. FR693803），包含2771bp碱基，其中包括2118bp的开放阅读框（ORF）编码705个氨基酸。5、考察了这三个基因在不同组织器官中的表达水平及诱导表的水平，结果发现这三个基因在根茎叶中均有表达，SmRAS在茎中表达最高、SmCYP98A14在根中表达最高、SmCPR在叶中表达最高。诱导表达研究表明，这三个基因均能被甲基茉莉酸（MeJA）及脱落酸（ABA）诱导表达上调。6、通过RNAi干扰研究验证了SmRAS及SmCYP98A14基因在酚酸类生物合成过程中的功能。RNAi干扰SmRAS及SmCYP98A14能够明显降低丹参毛状中迷迭香酸和丹酚酸B的含量。RNAi-SmRAS效果最显著株系中迷迭香酸和丹酚酸B的含量均低于CK的20%，RNAi-SmCYP98A14效果最显著株系中迷迭香酸和丹酚酸B的含量为于CK的30%。对这两个基因的RNAi均导致酚酸类合成途径上其它基因表达明显下调，以上结果证明了SmRAS及SmCYP98A14在迷迭香酸和丹酚酸B生源途径上的重要性。本研究采用的探索生源途径的方法也为其它探索生源途径的研究提供借鉴。本研究通过对酚酸类生源途径的探索及途径上关键酶基因的克隆研究，拓展了人们对酚酸类化合物生物合成的认识，帮助人们更加系统深入的理解酚酸类的生物合成机制，从而推动了丹参中酚酸类成分代谢工程研究。