芒果炭疽病(Colletotrichum gloeosporioides Penz.)是芒果重要的病害。多菌灵、甲基托布津、苯菌灵、特克多等苯并咪唑类杀菌剂(benzimidazoles)对该病害具有良好的防治效果。但此类杀菌剂是单作用位点的内吸性杀菌剂,若不合理使用,容易使病菌产生抗药性。从我国芒果主产区采集炭疽病菌300多个菌株,对多菌灵的敏感性测定结果表明,芒果炭疽病菌在我国热区芒果上已产生了高水平的抗药性,有些菌株在多菌灵500μg/mL的PDA培养基上仍可正常生长,无法测定其EC50和EC90值,确认为质量性状抗性,且无性繁殖12代后,其抗性依然不变。对抗性菌株的性质测定结果表明,病菌的抗药性突变并不影响其各项生物学功能和寄生适合度。研究表明,大部分病原菌对多菌灵的抗性突变都与?-微管蛋白基因的单碱基突变有关,尤其发生在?-微管蛋白(tub2)第198位上的氨基酸突变是抗药性形成的主要原因。本研究对芒果炭疽病菌抗、感菌株两条?-微管蛋白基因tub1和tub2的全序列分别进行克隆和测序,对其序列分别进行比对,发现抗药性菌株中两条β-微管蛋白基因都发生了突变,其中发生在tub1中的氨基酸突变与抗药性的发生没有相关性。而在抗性菌株的tub2中,发现第198位氨基酸的突变具有一定的规律性,即在所有的抗性菌株中在此位点都突变为丙氨酸(Ala-A),而在敏感菌株中均为谷氨酸(Glu-E),推断tub2中第198位氨基酸的突变与病菌抗药性的形成有紧密的相关性。通过等位特异PCR和酶切的方法检测发现在其它抗药性菌株中也存在同样的现象,因此,认为tub2基因第198位氨基酸的突变是芒果炭疽病菌抗药性形成的主要原因。至此,我们基本探明了芒果炭疽病菌抗药性形成的分子机制,同时,也从中克隆了抗药性基因,突变了的tub2基因即为多菌灵抗性基因,此基因的克隆为绿僵菌的遗传转化打下了重要的基础。绿僵菌(Metarhizium.spp)是一种虫生真菌,能寄生8个目30科约200种昆虫、螨类及线虫。它致病力强、效果好,对人、畜、作物及害虫天敌无毒害,是当今虫生真菌研究的主要对象之一。我们也从海南的椰心叶甲中分离到了21个绿僵菌菌株,根据菌落、分生孢子及产孢结构的特征,初步鉴定为金龟子绿僵菌,并根据菌落的不同特征,把这些菌株分成了MA和MB两类。为了对这些菌株的分类作进一步的验证和定位,对MA和MB类菌株rDNA的ITS1-5.8S-ITS2分别进行了克隆和测序,使用MEGA3.1软件构建了绿僵菌属种或变种的系统发育树。结果显示,所构建的最大简约树和邻接树均将MA和MB菌株聚在金龟子绿僵菌小孢变种分支中,再对照其形态特征,最终将这些菌株鉴定为金龟子绿僵菌小孢变种(Metarhizium anisopliae var. anisopliae)。经测定,这些菌株对椰心叶甲的成虫和幼虫均有较强的致病力,致死率最高均可达100%。其中MA4菌株被用于田间的防治,取得了明显的成效,说明这些菌株对椰心叶甲具有很好的生防潜力。尽管绿缰菌对多种害虫有杀灭效果,但环境条件对绿僵菌的影响也较大,如温度、湿度、紫外光、杀菌剂、杀虫剂等。由于绿僵菌在应用时为分生孢子活菌制剂,因此,杀真菌剂对其有致命的影响。经测定,绿僵菌在多菌灵5μg/mL下便受完全抑制,而多菌灵在田间实际施用浓度为500-1000μg/mL,只要两者同时施用,绿僵菌将难以发挥其对害虫应有的毒力,因此,使绿僵菌获得对多菌灵的抗性至关重要。由于苯并咪唑类杀菌剂低毒、内吸性强、杀菌普广等特点,使其得到了广泛应用,此类药剂施用后,都会产生共同的衍生物多菌灵或它的乙基同系物乙基多菌灵,是与病菌相互作用的最后产物。因此,研究对多菌灵的抗性是研究绿僵菌对此类杀菌剂抗性的关键,也是绿僵菌抗药性改良的主要目标之一。要获得绿僵菌抗药性菌株,可采取下述途径:一是自然筛选,即从田间收集大量的菌株然后进行筛选。目前,在海南受病菌自然感染的椰心叶甲中只分离到几十个菌株,经测定,这些菌株对多菌灵都较敏感。当然,菌株数量越大,成功筛选的几率也越高,但要从海南岛受害的几百万株椰子树中搜集椰心叶甲僵虫,并从中分离出更多菌株的工作量很大,而且也不一定就能筛选到抗药性菌株,因此,自然筛选的方法难度较大。二是抗性诱变,通过紫外诱变获得了对多菌灵的抗性菌株,在600μg/mL的条件下仍可缓慢生长,抗性提高120倍以上,但这些诱变体在紫外光的再次照射后均发生了回复突变。因此,若把这些菌株用于田间的防治,由于太阳紫外线的照射,也可能表现出同样的不稳定性。因此,用紫外光诱变获得的抗性菌株不适于田间的推广应用。三是本项目采用的遗传转化方法,利用芒果炭疽病菌多菌灵抗性基因(tub2),构建合适的载体,以根癌土壤杆菌介导的方法,把该基因导入到绿僵菌中,使之也获得对多菌灵的抗性。在载体构建中,以tub2基因、质粒pCAMBIA1300和pBHt2(含TrpC)为基础,真菌强启动子TrpC与tub2以套叠PCR的方法相连,其连接产物为TrpC-tub2,同时, pCAMBIA1300以Bst XI/XhoI酶切去除CaMV35S-hph获得线性大片段,然后以此线性大片段与TrpC-tub2相连。由于tub2序列内含有Bst XI和Xho I等酶切位点,无法在TrpC-tub2的两端设计合适的粘端直接与pCAMBIA1300线性大片段相连。因此,TrpC-tub2与pCAMBIA1300大片段的连接只能先补平后再以平端连接,然后以酶切法鉴定其插入方向的正确性。载体成功构建后转化根癌土壤杆菌GV3103,即用于绿僵菌的遗传转化。在这个载体中,多菌灵抗性基因既作为转化的目的基因,同时也为筛选标记基因。对绿僵菌遗传转化体系进行了多处理比较,获得了优化的转化体系:多菌灵浓度最低为4.0μg/mL;头孢霉素(Cef)的最佳使用浓度为250μg/mL;溶解绿僵菌的最佳溶剂为0.01%的Triton X-100;绿僵菌分生孢子和根癌土壤杆菌浓度分别以1×106～1×108conidia/mL和0.60～0.75OD600为宜、共培时间为2-3d、IM固体培养基含AS200μmol/L;AS处理根癌土壤杆菌最佳浓度为450μmol/L、最佳时间为6h。对转化子进行了进一步的培养、分析,发现了一些菌落形态、颜色突变的转化子,另有致病力降低的转化子,这些现象说明了T-DNA可能已插入到绿僵菌功能基因区中。对这些转化子进行了PCR鉴定,并对其PCR产物进行克隆和测序,验证和确认了包括TrpC-tub2序列的T-DNA已插入到绿僵菌的基因组中。转化子对多菌灵的敏感性测定结果表明,抗性只比原来提高2.8倍,虽然无性繁殖12代后仍可维持原有的抗性,但在多菌灵10μg/mL中已完全不能生长,说明了导入的tub2基因并没有得到理想的表达,其原因有待于进一步研究。总体而言,本项目基本探明了芒果炭疽病菌抗药性形成的分子机理,克隆了多菌灵抗性基因tub2,并成功构建了以多菌灵为筛选标记的真菌转化载体、初步探索了以根癌土壤杆菌为介导的金龟子绿僵菌的遗传转化,为下一步的研究打下了重要基础。