葡萄早熟芽变及其亲本果实发育转录组对比分析

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葡萄(Vitis vinifera L.)是世界范围内栽培价值较高的一种果树,人们对其变异性状的研究非常多,主要集中在果实皮色、果实大小、植株大小、成熟期、花穗等方面。然而,对于葡萄芽变品种及其亲本在果实发育过程中的基因表达模式的差异,却研究甚少。‘峰早’是‘巨峰’葡萄的早熟芽变品种,其成熟期比‘巨峰’早30 d左右,是研究葡萄果实成熟的有利基因型。本试验利用RNASeq方法,建立了‘巨峰’和‘峰早’品种坐果至成熟时期果皮和果肉基因文库40个,以期了解‘峰早’和‘巨峰’葡萄果实发育过程中基因表达模式的差异。主要结论如下:(1)获得‘巨峰’和‘峰早’果肉和果皮中表达的基因序列共447,300,854条。依据葡萄基因组12×V2.1注释进行基因预测,‘巨峰’和‘峰早’果肉和果皮中分别有23,178和22,982条基因表达。其中,果肉中共同表达基因20,944个,差异表达基因535个,果皮中共同表达基因20,804个,差异表达基因905个。(2)差异表达基因分析。通过DESeq2分析,‘巨峰’和‘峰早’果肉中的差异表达基因有tmv resistance protein n-like(VIT200s0238g00060)以及superoxide dismutase(VIT214s0030g00950),且表达水平均下调。果皮和果肉间差异显著的有三个基因,VIT213s0067g01100(disease resistance protein at3g14460-like),tmv resistance protein n-like(VIT200s0238g-00060)以及superoxide dismutase(VIT214s0030g00950)。(3)独特(unique)表达基因GO分析。生物学过程(biological process)的viral reproduction在‘巨峰’和‘峰早’的果皮中表达水平有所不同,同样是生物学过程的locomotion在‘巨峰’和‘峰早’的果肉及果皮中有着明显差异。用GO数据库对独特表达基因(仅在‘巨峰’或者仅在‘峰早’中表达)进行分类的结果表示,生物学过程的rhythmic process仅在‘峰早’的果皮中存在。分子功能的protein tag仅在‘峰早’的果皮中存在,metallochaperone也仅在‘巨峰’的果皮和‘峰早’的果肉中有。(4)基因表达模式分析。为了更进一步的了解‘峰早‘和‘巨峰’间表达基因的表达模式的转录差异,基于RPKM(Reads Per kb of per Million reads)法,对结果用K平均算法进行聚类分析。K均值结果表示,‘巨峰’和‘峰早’无论果肉中还是果皮中,大多数基因表达水平无很大差异,Cluster 10有着果肉中数量最多的基因(5519个),Cluster 12有着果皮中数量最多的基因(5745个)。果肉和果皮间表达模式的对比表明,有15个组在‘巨峰’和‘峰早’中都是同时存在的。‘峰早’果肉的Cluster 2的基因组别比较特殊,表达水平在开始比较高,并且随着果实的发育,表达水平在不断降低。然而,相同的基因在‘巨峰’中并没有变化那么多。(5)运用荧光实时定量PCR(q RT-PCR)确定‘巨峰’和‘峰早’的差异表达基因的表达水平。Tmv resistance protein n-like,disease resistance protein at3g14460-like和superoxide dismutase在‘巨峰’和‘峰早’的果肉及果皮中有明显差异的表达水平。Class iv chitinase在‘巨峰’及‘峰早’的果肉中表达水平也有差异,‘峰早’果肉中class iv chitinase的表达水平比‘巨峰’中的要高。Pectinesterase qr和photosystem ii protein d2在‘巨峰’和‘峰早’的果皮中表达水平有明显的不同。q RT-PCR结果说明RNA-Seq分析结果的准确性。(6)推测‘峰早’中的ROS水平高于‘巨峰’中ROS水平。ROS的水平越高,可以使ROS产物保持在损伤程度以下,并刺激‘峰早’中成熟进程提早开始。用选择的基因的表达验证转录组结果。本试验找出‘峰早’不同于‘巨峰’的三个差异基因,superoxide dismutase,resistance protein n-like,disease resistance protein at3g14460-like,并推断这些基因的改变是由于ROS水平的提高,而ROS水平的提高,则导致‘峰早’葡萄的提前成熟。这些结果初步解释了‘峰早’葡萄早熟的分子机理,为葡萄成熟机制提供了新的信息,找出了有可能导致葡萄早熟突变的候选基因,并对现行的葡萄果实成熟的分子研究提供了重要资源。这些发现可能帮助我们更好的了解果实成熟的过程。
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