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鸡球虫是一种寄生于鸡肠上皮细胞内的原虫,不仅影响鸡的生长发育,同时也为畜禽业造成严重的经济损失。其中,致病性最强的是寄生于鸡盲肠内的柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）,其裂殖体于盲肠上皮细胞中大量增殖,导致盲肠肿胀和肠黏膜损伤,并伴有上皮增厚等现象。据报道,全世界每年因该病所导致的经济损失多达数十亿美元。在当代畜牧业生产过程中,因各类药物的滥用,不仅造成了药物残留及耐药虫种等危害,而且还会消灭大量益生菌,从而打破了畜禽肠道内正常菌群的平衡。乳酸杆菌因其具有绿色、安全、益生效果和呈递外源抗原的作用而占据优势地位,将乳酸杆菌作为新型抗球虫疫苗的活载体也拥有十分广阔的前景。由于球虫拥有非常复杂的生活史,加之一种抗原蛋白只在部分阶段表达且具有周期性,可能会造成以单一抗原为基础的新型抗球虫疫苗只能提供部分免疫保护效果。因此,急需找到一个快速且有效的解决措施来改善抗原的免疫原性。为了改善抗原的免疫原性,本课题通过研究鸡球虫的生活史及其抗原蛋白的表达,选择球虫不同阶段表达的不同抗原蛋白,并对其进行蛋白氨基酸序列分析,选取其中免疫原性较好的抗原片段构建融合蛋白重组乳酸杆菌疫苗,以此来改善抗原的免疫原性,为下一步研制新型抗球虫疫苗提供了选择。具体研究内容如下:本课题从致病性较高的鸡柔嫩艾美耳球虫选取了其子孢子、裂殖子和配子体等入侵阶段表达的EtMIC1、EtMIC3、EtProfilin和EtGam56四种有效抗原蛋白。据研究报道,EtMIC1、EtMIC3、EtProfilin和EtGam56为鸡柔嫩艾美耳球虫蛋白,对于鸡球虫病具有一定的保护力。其中,EtMIC1、EtMIC3和EtProfilin表达于子孢子和裂殖子阶段,EtGam56蛋白在配子体阶段表达。本课题通过DNA Star等分析软件对其各自的氨基酸序列进行分析,并结合已发表的关于这四个蛋白抗原性的报道,分别选择其中免疫原性较好的抗原片段作为重组乳酸杆菌活载体疫苗的候选抗原基因。本研究参照Gen Bank提供的4种抗原蛋白（EtMIC1、EtMIC3、EtProfilin和EtGam56）基因序列,合成特异性引物,通过PCR的方法扩增选定的基因序列,将扩增的基因序列与pET28a（+）载体利用同源重组酶进行线性串联,菌液PCR检测和测序鉴定正确,结果显示成功构建了pET28a-EtMIC1-EtMIC3-EtProfilin-EtGam56重组原核表达质粒。本研究以构建的重组原核表达质粒为模板,PCR扩增MG（EtMIC1-EtMIC3-EtProfilin-EtGam56）串联片段,又以实验室构建的P32-murO-MIC8-FLAG-CPE质粒为模板,PCR扩增PMFC（P32-murO-FLAG-CPE）质粒骨架,使用同源重组酶,将MG串联片段与PMFC质粒骨架连接,构建PMFC-MG（P32-murO-MG-FLAG-CPE）重组质粒,然后将其电转入乳酸杆菌表达活载体,构建了融合蛋白重组乳酸杆菌活载体疫苗PMFC-MG,同样的方法又构建了重组乳酸杆菌活载体疫苗PMFC-EtMIC1、PMFC-EtMIC3和PMFC-EtProfilin。经SDS-PAGE、Western-blot及IFA检测蛋白表达,结果显示成功构建了4种重组乳酸杆菌疫苗,其中融合蛋白PMFC-MG-NC8的表面表达率为73.26%,重组蛋白PMFC-EtMIC1-NC8的表面表达率为51.15%,重组蛋白PMFC-EtMIC3-NC8的表面表达率为46.66%,重组蛋白PMFC-EtProfilin-NC8的表面表达率为48.28%。结果表明4种重组乳酸杆菌疫苗均可以表达重组蛋白,其中PMFC-MG-NC8表达率最高,与重组蛋白相比差异显著（P＜0.05）,说明融合蛋白具有更高的蛋白展示效率。为研究融合蛋白重组乳酸杆菌疫苗的免疫保护效果,我们购买1日龄无免疫海兰褐雏公鸡,进行动物免疫保护性试验。试验分为7组,每组20只,Ⅰ组和Ⅱ组为PBS对照组,Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ组分别口服免疫NC8乳杆菌、PMFC-EtMIC1-NC8重组乳杆菌、PMFC-EtMIC3-NC8重组乳杆菌、PMFC-EtProfilin-NC8重组乳杆菌、PMFC-MG-NC8重组乳杆菌。从第一天开始Ⅰ、Ⅱ组每隔一天给鸡口服接种500μL PBS,其余组接种同剂量的乳酸菌（2×10~9CFU/mL）,直至14d除Ⅰ组外均口服接种新鲜的E.tenella孢子化卵囊1.5×10~4。通过检测平均增重、盲肠病变、卵囊排出量、ACI及血清黏膜抗体等指标评价其免疫保护效果。动物试验结果显示融合蛋白免疫组相较于感染球虫不免疫组（Ⅱ组）,体重显著增长,盲肠病变及卵囊排出均显著降低（P＜0.05）,说明融合蛋白重组乳酸菌不仅能缓解E.tenella造成的生长迟缓和盲肠病理损害,还能有效抑制鸡球虫的入侵和在鸡体内的生长繁殖;融合蛋白免疫组ACI值最高,可达175,与感染球虫不免疫组（Ⅱ组）ACI值相比,有显著差异（P＜0.05）,表明融合蛋白可以为鸡提供良好的抗球虫免疫保护力;淋巴细胞增殖效果及其外周血淋巴细胞中CD4+/CD8+的比值方面,融合蛋白免疫组的CD4+/CD8+的比值显著高于感染球虫不免疫组（Ⅱ组）,结果显示融合蛋白可以有效诱导细胞免疫;在血清特异性抗体IgG及其粘膜免疫抗体SIgA方面,融合蛋白免疫组相较于感染球虫不免疫组（Ⅱ组）,血清抗体IgG效价水平和粘膜抗体SIgA效价水平显著升高,说明融合蛋白可以引起有效的体液免疫并产生较高的血清抗体和粘膜抗体,表明融合蛋白重组乳酸杆菌疫苗在预防E.tenella感染方面可以提供有效的抗球虫免疫保护效果。上述研究均表明将乳酸杆菌等益生菌作为活载体,在其表面表达球虫抗原蛋白,以此构建重组活载体疫苗,可以诱导机体产生较高的免疫应答,从而提高机体的免疫力,对防治鸡球虫病影响深远,这些研究将为下一步新型抗球虫疫苗的研发提供重要的理论参考。