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随着肝癌患者趋于年轻化,肝癌已成为一个主要的全球性健康问题。目前,在肝癌治疗过程中,手术、化疗和射频消融术治疗均能有效减弱或抑制肿瘤的生长,但它们在预防肿瘤的转移和复发方面能力还是有限的。因此,对于绝大多数的晚期癌症患者,化疗还是必须的,也是最有效、最重要的方法。在化疗过程中,顺铂引起的毒副作用使其抗癌疗效受到限制,因此寻找一种毒性作用小、或能减轻毒副作用的化疗辅助药物成为现在癌症治疗中一种新的有效策略。大量研究已经证实,一些中草药成分具有抗癌效果,其中关于银杏酚的抑癌研究已有很多报道。银杏酚对于肿瘤细胞的存活、增值、侵袭及感染等方面均有作用,但是关于其抑癌作用机理的研究还未明确。自噬与凋亡是细胞内两个重要的调控机制,与肿瘤细胞的增长、生殖、转移、侵袭和代谢等密切相关。本研究就银杏酚C17:1(Ginkgol C17:1)对化疗状态下肝癌细胞、正常肝细胞及化疗荷瘤机体的自噬与凋亡相关的抗癌机制展开研究。本研究的实验内容与结果:(1)银杏酚C17:1抑制化疗肝癌细胞HepG2自噬、促进其凋亡,并且通过不同的信号通路对其进行调控。通过MTT法检测HepG2细胞活性,RFP-GFP-LC3双标腺病毒转染实验检测细胞内LC3自噬小体的含量和分布以及自噬流的强弱,Western blotting法检测自噬蛋白(Beclin1、LC3Ⅰ/Ⅱ、p62)、凋亡蛋白(Bax/Bcl-2、Cleaved caspase3)和通路蛋白的表达,PCR法检测自噬蛋白Beclin1基因水平的表达,Hoechst染色检测细胞核畸变,免疫荧光法检测凋亡蛋白Cleaved caspase3的表达。结果表明,银杏酚C17:1与顺铂单独使用均能抑制肝癌细胞HepG2的生长;联合应用后,银杏酚C17:1能进一步增强顺铂的抗肿瘤活性。在HepG2细胞中,单用银杏酚C17:1能诱导HepG2自噬的发生;化疗状态下即顺铂作用的细胞自噬也被激活,且为保护性自噬;然而银杏酚C17:1与顺铂联合应用时,激活的自噬又被抑制。此外,银杏酚C17:1与顺铂均能诱导HepG2细胞发生凋亡,联合应用时凋亡进一步增强。总体来说,在HepG2细胞中,银杏酚C17:1能抑制顺铂诱导的保护性自噬,增强顺铂诱导的凋亡水平,来增强顺铂的抑癌效果。通路研究发现,银杏酚C17:1通过AMPK/ULK 1这条通路调控化疗状态下肝癌细胞的自噬,通过PI3K/AKT/mTOR这条通路来调控化疗细胞的凋亡,而AMPK的调控与p53之间存在相关性。(2)银杏酚C17:1促进化疗状态正常肝细胞L02自噬,对抗其凋亡,并能启动Nrf2通路。通过MTT法检测L02细胞活性,RFP-GFP-LC3双标腺病毒转染实验检测细胞内LC3自噬小体的含量和分布以及自噬流的强弱,Western blotting法检测自噬蛋白(Beclin1、LC3Ⅰ/Ⅱ、p62)、凋亡蛋白(Bax/Bcl-2、Cleaved caspase3)和通路蛋白的表达,PCR法检测自噬蛋白Beclin1与NADPH氧化酶基因水平的表达,Hoechst染色检测细胞核畸变,免疫荧光法检测凋亡蛋白Cleaved caspase3的表达。结果表明,顺铂单独使用时能抑制正常肝细胞L02的生长,而银杏酚C17:1对其抑制效果不明显,只有在银杏酚C17:1高剂量刺激下才表现出明显的抑制作用。联合应用时,低剂量银杏酚C17:1减弱了顺铂的抑制作用,中剂量银杏酚C17:1对顺铂作用没有影响,高剂量银杏酚C17:1增强了顺铂对L02的抑制作用。在L02细胞中,单用银杏酚C17:1能诱导其自噬的发生,化疗状态下即顺铂作用的细胞自噬没有明显的变化;联合应用时,银杏酚C17:1增加了化疗状态L02的自噬水平。此外,顺铂能诱导L02细胞凋亡的发生,而银杏酚C17:1对其没有明显作用;联合应用时,中低剂量银杏酚C17:1均减弱了顺铂对L02的凋亡作用。总体说明,在L02细胞中,银杏酚C17:1能诱导化疗肝细胞保护性自噬的发生,减弱顺铂诱导的凋亡从而起到保护正常肝细胞的作用。同时,在正常肝细胞中,银杏酚C17:1也主要是通过AMPK/ULK1这条通路调控化疗状态下肝细胞的自噬,通过PI3K/AKT/mTOR这条通路来调控化疗肝细胞的凋亡的。此外,银杏酚C17:1能激活正常肝细胞的Nrf2保护途径,启动下游抗氧化元件NADPH氧化酶的表达来抵抗顺铂造成的损伤,最终达到保护细胞的目的。(3)银杏酚C17:1增强对肝癌荷瘤小鼠的化疗疗效,并抑制化疗肝癌细胞的自噬,促进其凋亡。昆明小鼠接种heps肝癌细胞分别构建皮下种植实体瘤模型与原位移植瘤模型。按实验要求分组给药治疗。荷瘤小鼠出死前眼球取血并处死:ELISA试剂盒检测血清中细胞因子的含量,取瘤称重并记录分析,Western blotting和IHC法检测肿瘤组织中自噬与凋亡以及信号通路相关蛋白的表达,HE染色检测肿瘤组织变化。体内实验结果表明,单用以及联用药物组对肿瘤生长均有明显的抑制作用。联合作用组,荷瘤小鼠肿瘤生长抑制较单用药物组明显。而且联用组小鼠精神状态明显好于单用顺铂组。此外,通过免疫器官与免疫相关细胞因子的检测,证实银杏酚C17:1能提高化疗荷瘤小鼠的机体免疫力。通过对肿瘤组织的检测发现,银杏酚C17:1能抑制顺铂诱导的自噬,增强顺铂诱导的凋亡,以及抑制癌症转移等,这些结论均与体外细胞实验研究结论一致。体内体外实验均证实,在银杏酚C17:1与顺铂联合治疗肝癌的过程中,银杏酚C17:1能通过调控化疗细胞的自噬与凋亡增强顺铂的抗肿瘤活性,同时还能增强机体免疫力,保护正常肝细胞免受顺铂造成的损伤。该研究为化疗辅助药物的机制研究提供了一定理论依据。