细胞免疫应答在疾病控制过程中发挥重要作用,这在小鼠等模式动物中已经得到了确认,但由于缺少相关生物试剂、禽类免疫系统特殊性等因素,家禽中细胞免疫应答的研究受到较大的限制,严重制约了禽病相关疫苗的研发和应用。因此,建立禽类细胞免疫应答检测分析技术将进一步推动禽类相关生物制品的开发和疾病的有效控制。本研究以鸡为动物模型,利用现有的生物材料,建立一套评价鸡细胞免疫应答的分析技术体系,包括T细胞增殖检测方法、鸡T细胞亚群分析技术以及细胞毒性T细胞的杀伤能力测定方法等,为家禽细胞免疫应答的研究提供了新的手段和技术;分别以鸡白痢沙门菌候选疫苗株和鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗免疫雏鸡,利用所建立的细胞免疫技术平台评价上述疫苗诱导的细胞免疫应答特性,为禽病疫苗的研制和改进提供新的思路和指导。1.鸡细胞免疫应答检测方法的建立无菌采集鸡脾脏,制备脾脏单细胞悬液,分离淋巴细胞,以ConA刺激淋巴细胞,利用BrdU ELISA方法建立了鸡T细胞增殖检测技术;利用流式细胞术建立了鸡T细胞亚群分析、T细胞亚群分选和细胞凋亡检测技术;同时利用磁珠标记的抗体建立了鸡CD8+T细胞的磁分选技术。BrdU ELISA检测结果显示,与未刺激组相比,ConA刺激后能够明显地检测到T细胞增殖,且重复性较好。在流式细胞术分析和分选结果中,CD4+和CD8+T细胞亚群分群明显,分选后CD8+T细胞纯度达到97%以上,分选效果明显;通过磁珠分选技术获得的CD8+T细胞纯度可达94%以上,分选速度快,耗时短。此外,Annexin V-FITC/PI双标记法可有效地检测鸡细胞凋亡和死亡情况。以上建立的细胞免疫检测技术,为家禽细胞免疫应答的分析和评价提供了有效技术支撑。2.鸡白痢沙门菌疫苗候选株诱导细胞免疫应答的分析与评价将鸡白痢沙门菌减毒疫苗候选株S06004△spiC以肌肉注射的方式免疫3日龄雏鸡,同时以PBS注射组作为对照,以建立的鸡细胞免疫应答分析技术平台评价S06004AspiC诱导的免疫应答。细胞增殖检测结果显示,与PBS对照组相比,S06004△spiC免疫组淋巴细胞在鸡白痢沙门菌特异性抗原体外刺激后分别在免疫后14 d(P<0.001)和21 d(P<0.01)发生显著增殖。T细胞亚群分析结果显示,免疫后第14、28、35 d,CD8+T细胞亚群比例显著升高。在CTL杀伤实验中,以巨噬细胞为靶细胞,免疫组CTL细胞的杀伤能力明显高于未免疫组(P<0.05)。ELISA检测血清中细胞因子结果显示,血清中IFN-y含量在免疫后第5 d开始均高于对照组。血清抗体测定结果显示,S06004AspiC免疫后第7 d可以检测到IgG抗体,第21 dIgG抗体含量达到最高值。以上结果表明,本研究所建立的鸡细胞免疫应答分析技术平台可用于鸡白痢沙门菌减毒疫苗候选株S06004△spiC诱导细胞免疫应答的评价,S06004△spiC能够诱导较强的细胞免疫应答,为鸡白痢沙门菌疫苗的开发和研制提供了重要数据支撑。3.鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗诱导细胞免疫应答的分析与评价将鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗通过滴鼻滴眼方式免疫3日龄雏鸡,同时设置PBS免疫组作为对照,检测疫苗所诱导的免疫应答特性。与PBS对照组相比,疫苗免疫组在第7、21、28 d时T细胞发生显著增殖;免疫后第28 d,T细胞亚群均发生了显著性变化;以肾细胞为靶细胞,免疫组CTL细胞具有较强的杀伤能力,且高于未免疫组;细胞因子转录水平检测结果表明,免疫组脾脏中各细胞因子的表达量均高于对照组,其中IL-2、IL-4、IL-10的表达量在第14d差异显著。气管灌洗物中IgA抗体水平于免疫后第7 d即可检测到,且在第28 d达到峰值;免疫后第21 d血清中IgG抗体水平显著高于对照组,且第28 d差异最为显著。综上表明,鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗能够诱导较强的鸡细胞免疫应答、体液免疫应答和黏膜免疫应答。本研究利用所建立的鸡细胞免疫应答分析技术对鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗诱导细胞免疫进行评价,为该疫苗的使用和改进提供了新的理论依据。