目前，外源基因表达载体多以抗生素抗性基因作为选择标记，对于基因治疗和基因免疫用表达载体，这些抗性标记基因的存在有可能引起一系列生物安全性问题。因此，需用更为安全的非抗生素抗性标记表达载体，其中染色体．质粒平衡致死系统具有广泛的应用前景。 为了构建用于动物基因治疗和基因免疫的非抗性标记表达载体，我们将DH5a大肠杆菌在含有胸腺嘧啶核苷和3-甲氧2-氨嘧啶的CBT培养基上进行选择培养，筛选得ThyA-突变株21株。这些突变株在不含胸腺嘧啶核苷的CB琼脂平板上不生长，只有在添加胸腺嘧啶核苷的培养基或转化thyA表达载体后才能在正常培养基生长。为了研究thyA基因突变的分子机理，用高保真PCR法克隆4个突变株的thyA基因，序列分析结果显示，4、7、13号菌株在70位碱基起有6个碱基缺失，导致25位甘氨酸和26位苏氨酸的缺失；6号突变株在92位碱基由G突变为A，导致31位甘氨酸被天冬氨酸替换。用PCR克隆野生大肠杆菌的ThyA基因，将其克隆入原核表达载体，用重组大肠杆菌表达的重组蛋白免疫小鼠，用获得的抗血清进行免疫转印试验，结果发现突变株的ThyA基因仍能表达。 根据鼠伤寒沙门氏菌菌株thyA基因序列设计一对引物，用PCR扩增包括启动子的thyA基因，将序列正确的基因取代表达人溶菌酶基因的真核载体pcDNAKYZ中的卡那抗性基因，获得非抗性选择标记表达载体pDTALYZ。将其转化ThyADH5a大肠杆菌，转化菌涂布不含胸腺嘧啶核苷的CB平板，筛选得非抗性标记重组大肠杆菌。在CBt液体培养基传20代未发现质粒丢失，酶切鉴定正确。将pcDNAKLYZ重组菌和pDTALYZ重组菌在相同条件下，以普通的LB为培养液进行高密度发酵培养，发现两种重组菌的生长曲线无明显差异；发酵结束后，定量取样提取质粒DNA和进行定量测定，结果显示两种重组菌的质粒产量无差异；定量取样分别在普通和选择培养基上培养，发现两种重组菌的质粒丢失率分别为38.1％和15.7％。