胃癌是世界范围内致死率第二的恶性肿瘤,其被广泛认为同幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染及继发的炎症反应有密切关系。通过促进包括白细胞介素6、8在内的多种炎症因子释放,幽门螺旋杆菌在胃癌的发生、增殖、转移等发展过程中发挥了重要作用。总的来说,IL-6激活的STAT3在胃肠道上皮细胞的恶性转化中中扮演了关键的角色。作为多条癌基因通路的交汇点,STAT3的激活被发现能促进多种肿瘤的增殖、存活、血管生成以及转移,并能够抑制抗肿瘤免疫。但是,转录因子STAT3在肿瘤细胞中被持续激活的原因尚未完全阐明。亲环素B(Cyclophillin B,Cyp B)属于亲环素家族,是环孢素A的细胞内受体,其肽酰脯氨酰异构酶活性在蛋白质折叠过程中有重要作用。有意思的是,近期研究发现在黑色素瘤和恶性胶质瘤中,Cyp B的存在对于STAT3的激活有不可或缺的作用。敲除或药物抑制Cyp B导致JAK/STAT3通路的抑制及细胞死亡。此外,Cyp B被发现在多种肿瘤中过表达,但是Cyp B的过表达的机制及其同STAT3的关系尚不明确。Micro RNA是一类小RNA,通过结合靶基因信使的非翻译区导致其翻译抑制或直接降解。我们前期的生物信息学分析结果显示mi R-520d-5p在Cyp B的3’非翻译区具有潜在结合位点,且二者表达水平在胃癌细胞和组织中均负相关。因此我们进而验证了mi R-520d-5p是否是Cyp B的上游调控分子的假说。本文中我们提供了证据显示一条由IL-6诱导的Cyp B/STAT3/mi R-520d-5p反馈通路在胃癌发展过程中的促进作用。我们研究发现Cyp B的过表达是STAT3在胃癌中激活的必要条件;随后我们证实mi R-520d-5p在转录水平直接抑制Cyp B的表达;此外,mi R-520d-5p也是STAT3的直接调控基因:这条反馈通路的发现,有助于理解幽门螺旋杆菌感染和炎症反应造成IL-6分泌促进胃癌中STAT3持续激活的原因,并为治疗胃癌恶性进展提供新的思路。【方法】包含90对胃癌和癌旁正常组织的组织微芯片用于检测Cyp B、STAT3及mi R-520d-5p的表达。100例胃癌病人及50名正常志愿者血清被收集用于检测血清中Cyp B的表达进而分析早期诊断价值。我们构建了Cyp B、STAT3的过表达载体和sh RNA载体并包被慢病毒进行功能获得缺失模型的建立。合成的mi R-520d-5p的mimics、inhibitors,及agomir、antagomir被用于mi R-520d-5p的过表达和抑制。BGC823、SGC7901细胞转染后,采用XTT细胞增殖实验和平板克隆形成实验分析细胞生长和增殖。细胞经PI和Annexin V染色后采用流式细胞分析细胞周期和凋亡比例。裸鼠皮下成瘤实验用于体内验证细胞增殖的影响。蛋白印迹实验和聚合酶链反应分别用于分析细胞中相应分子的蛋白水平和RNA水平的表达。双荧光素酶报告基因实验和染色质免疫共沉淀实验用于证实mi R-520d-5p同Cyp B的非翻译区的直接结合以及STAT3转录因子同mi R-520d-5p的启动子区域的直接结合。免疫组化和原位杂交用于检测Cyp B、p STAT3及mi R-520d-5p在胃癌组织中的表达。细胞免疫荧光实验用于经IL-6刺激后分析相应蛋白的细胞亚定位。【结果】1.Cyp B在胃癌组织和胃癌患者血清中表达升高并同胃癌进展相关。Cyp B被发现同癌旁正常组织相比,在胃癌组织中的表达明显升高。相关性分析进而发现,高水平的Cyp B同恶性肿瘤表型密切相关,并同缩短的生存期有关。Cox回归分析也显示,高水平Cyp B是独立的预后危险因素。2.沉默Cyp B表达在体内和体外抑制胃癌细胞生长。蛋白印迹实验显示,Cyp B在多种胃癌细胞系中的表达同永生化正常胃上皮细胞GES-1相比明显升高。随后,BGC823和SGC7901细胞被转染了Cyp B的sh RNA。XTT增殖实验和平板克隆形成实验发现沉默Cyp B后细胞生长减缓。流式细胞分析显示细胞周期发生了G0/G1期的阻滞,且细胞凋亡率显著升高。此外,体内实验同样显示,抑制Cyp B的表达后裸鼠成瘤体积和重量降低。3.Cyp B通过影响STAT3激活调控胃癌增殖。我们随后通过免疫组织化学方法检测了p STAT3在胃癌组织中的表达,发现胃癌组织中Cyp B同p STAT3的表达水平均明显升高,且二者有正相关关系。有趣的是,胃癌细胞经IL-6刺激后,部分细胞中Cyp B的亚细胞定位从细胞浆向细胞核迁移。此外,Cyp B的小干扰RNA导致了JAK/STAT3通路中JAK2和STAT3的磷酸化水平的降低,但并未影响其总蛋白水平。随后共转染实验证实,STAT3的小干扰RNA能够逆转Cyp B沉默对胃癌细胞增殖的促进作用。这说明STAT3的激活介导了Cyp B对胃癌增殖的调控作用。4.mi R-520d-5p通过直接结合Cyp B非翻译区抑制Cyp B的表达。通过多个micro RNA靶基因数据库进行分析,我们筛选到若干可能调控Cyp B的micro RNA,并将其mimics分别转染胃癌细胞系。结果发现,mi R-520d-5p能够抑制Cyp B的表达。双荧光素酶报告基因实验证实,mi R-520d-5p能够直接结合Cyp B的3’端非翻译区。QRT-PCR和western Blotting实验进一步证实,mi R-520d-5p在转录水平导致Cyp B的m RNA降解。这些实验证实,mi R-520d-5p是Cyp B上游的直接调控分子。5.mi R-520d-5p在体内和体外通过靶向Cyp B抑制胃癌增殖。为探索mi R-520d-5p调控胃癌增殖的机制,我们建立了mi R-520d-5p的功能获得、缺失模型。随后的功能实验证实,无论在体内还是体外,mi R-520d-5p均抑制胃癌细胞增殖,促进细胞凋亡。随后含有野生型和突变性3’-UTR的Cyp B表达载体同mi R-520d-5p被用于共感染细胞,XTT和克隆形成实验表明mi R-520d-5p能够减弱野生型3’-UTR的Cyp B载体对胃癌细胞增殖的促进作用,但不能逆转突变型3’-UTR的Cyp B载体的作用。流式细胞周期和凋亡分析实验得到了类似的结果。这进一步说明,mi R-520d-5p通过结合Cyp B 3’-UTR调控胃癌细胞生长。6.mi R-520d-5p通过Cyp B调控STAT3磷酸化和入核。我们发现,mi R-520d-5p过表达抑制了JAK2和STAT3的磷酸化;而且IL-6刺激造成的STAT3磷酸化随时间和浓度的依赖性受到mi R-520d-5p过表达的抑制。另外,IL-6刺激能搞导致Cyp B和STAT3在细胞核的共定位;而mi R-520d-5p介导Cyp B沉默后,STAT3的入核受到了明显的抑制。随后的功能实验证实,STAT3的敲除能够逆转mi R-520d-5p的沉默对细胞生长和细胞周期、凋亡的影响。这些结果说明mi R-520d-5p通过调控Cyp B/STAT3轴影响STAT3的活化和胃癌细胞增殖。7.STAT3直接抑制mi R-520d-5p在胃癌细胞中的表达。为了进一步阐明Cyp B同STAT3活化之间的关系,我们对GES-1细胞采用IL-6的刺激,发现STAT3的磷酸化上调的同时,Cyp B的表达也明显升高;而mi R-520d-5p的过表达则能够抑制该现象发生,这提示STAT3可能反馈性参与mi R-520d-5p的表达调控。QRT-PCR结果证实,IL-6刺激能够在胃癌细胞中造成mi R-520d-5p表达的下调,而STAT3的sh RNA则逆转该现象发生。随后生物信息学预测发现,mi R-520d-5p的启动子区域存在多个潜在的STAT3的结合位点。因此针对STAT3在不同位置的结合位点,我们建立了一系列mi R-520d-5p启动子的截短载体。双荧光素酶报告基因实验证实STAT3的结合位点位于-1329至-722bp。对该区域的两个结合位点分别或同时突变发现,当-733至-723bp区域发生突变时,STAT3依赖的mi R-520d-5p的调控出现缺失。染色质免疫共沉淀也证实STAT3蛋白能够同该区域DNA直接结合,而且经IL-6刺激后其结合的DNA增多。这些结果说明,STAT3通过直接结合mi R-520d的启动子区域,转录性抑制其表达。8.胃癌组织中存在Cyp B/STAT3/mi R-520d-5p的反馈环路。最后我们在胃癌组织中验证了该环路的中三个分子的相关关系。原位杂交结果发现,胃癌组织中mi R-520d-5p的表达同癌旁组织相比明显降低,且低水平的mi R-520d-5p患者预后较差,COX多因素分析结果也显示低水平的mi R-520d-5p是独立预后因素。此外,我们将90例胃癌患者按照mi R-520d-5p、Cyp B及p STAT3的表达水平高低进行分组和相关分析,发现低水平的mi R-520d-5p同Cyp B及p STAT3的表达升高有相关关系。【结论】总结本项研究,我们发现胃上皮细胞受炎症因子刺激后恶性转化过程中一条正反馈通路。幽门螺旋杆菌相关的慢性萎缩性胃炎诱导胃上皮细胞和巨噬细胞产生IL-6,进而激活了JAK2/STAT3通路并转录性抑制mi R-520d-5p的表达,从而导致后者的靶分子Cyp B的表达升高。Cyp B随后协助STAT3的磷酸化和入核激活,引起下游细胞增殖和凋亡分子的变化,促进胃癌发生发展,同时也进一步转录性抑制mi R-520d-5p的表达。从这个角度讲,胃癌细胞中mi R-520d-5p的表达缺失及Cyp B的过表达是STAT3持续性激活的原因之一。这条新的Cyp B/STAT3/mi R-520d-5p正反馈环路将为进一步理解胃癌中炎症-肿瘤转化提供重要理论基础,并为胃癌防治策略提供新的思路。