论文部分内容阅读
Nestin为第Ⅵ类中间丝蛋白,是神经干/祖细胞标志物,另外,nestin还表达于胚胎期胰腺细胞、肝细胞、血管内皮细胞、骨骼肌细胞、表皮基底层细胞和受损的星型胶质细胞,等。除此之外,nestin还在一些肿瘤细胞表达,例如:乳腺癌、肺癌、胰腺癌、胶质瘤、黑色素瘤和白血病等。但nestin表达对白血病细胞生物学特性的影响尚不清楚。白血病是一组造血细胞增殖、分化、凋亡异常的恶性肿瘤,通过联合化疗、放疗、靶向治疗和造血干细胞移植等治疗手段,患者的缓解率虽然得到提高,但5年存活率仅约为20%。由此可见,防治白血病仍然是一个棘手的临床问题。本研究通过检测nestin在白血病患者中的表达,应用RNA干扰技术下调nestin基因在髓系白血病K562细胞的表达后检测其增殖、凋亡、侵袭能力的变化,并分析其可能的作用机制,为深入探讨nestin在白血病细胞中的功能,阐明白血病的病因及发病机制,发现治疗靶点提供重要信息。本研究收集了 44例髓系白血病患者及16例健康人的外周血标本;125例白血病患者及14例缺铁性贫血患者的骨髓样本。用RT-PCR、western blot和免疫组化检测nestin的表达,并分析其临床意义。其次,检测nestin在K562细胞的表达,通过瞬时转染siRNA-nestin基因在K562细胞后36h,48h,72h,用RT-PCR和蛋白质印迹(western blot)检测nestin在K562细胞中的表达变化;MTS检测K562细胞增殖的变化,流式检测细胞周期和凋亡;transwell法检测细胞的侵袭能力;蛋白质印迹(western blot)法检测K562细胞侵袭转移相关分子MMP2、MMP9、VEGF、HSP70的表达。另外,用MTS检测黄芩及其联合siRNA-nestin对K562细胞增殖的影响。在外周血样本中,髓系白血病患者nestin mRNA表达阳性率为81.8%(36/44),而健康人的阳性率为6.3%(1/16)。nestinmRNA阳性患者的白细胞数高于nestin mRNA阴性患者,两组存在统计学差异(P=0.011);但两组患者的nestin mRNA表达与血红蛋白、血小板、INF-γ、TNF-β、IL-10、IL-6、IL-4、IL-2、IL12P70、IL-1β、IL-8以及患者的缓解率并不存在统计学差异(P>0.05)。骨髓样本中,12.8%(16/125)髓系白血病患者nestin蛋白表达阳性,而在缺铁性贫血患者未检测到nestin蛋白表达。高白细胞白血病患者的nestin蛋白表达量高于其它患者,存在统计学差异(P=0.015);在CML患者中Nestin蛋白表达阳性的强度与病情进展有关;但是nestin蛋白阳性患者和nestin蛋白阴性患者的血红蛋白、血小板和缓解情况不存在统计学差异(P>0.05)。在髓系白血病患者的骨髓涂片、骨髓切片中,用免疫组化检测到少量、散在的nestin阳性细胞。通过瞬时转染抑制K562细胞nestin基因表达48h,在倒置显微镜下,K562细胞的形态、折光性无明显变化。但RT-PCR和western blot的结果显示,实验组K562细胞nestin表达量明显下调。MTS实验结果显示,siRN-nestin干扰组的K562细胞生长抑制率为(87.7±4.9)%,与对照组比较存在统计学差异(P=0.012)。流式细胞术检测结果显示,实验组K562细胞周期G2期由(4.09±2.58)%增加为(24.12±3.81)%,与对照组比较,差异有统计学意义(P=0.025),提示细胞周期停滞于G2期;实验组K562细胞凋亡率由(5.04±0.31)%增加为(16.83±5.99)%,(P=0.027)。Transwell细胞侵袭实验显示,干扰nestin基因下调后,穿膜细胞数减少,侵袭率下降(P=0.011)。western blot检测侵袭转移相关蛋白表达的结果提示,抑制nestin基因表达后,与对照组比较,实验组HSP-70表达量为(56.6±4.9)%(P=0.0001)、pro-MMP2 为(85.1±1.7)%(P=0.008)、MMP2 为(45.8±2.4)%(P==0.0001)、pro-MMP9 为(54.6±19.8)%(P=0.012)表达下调,而 MMP9(P=0.257)、VEGF(P=0.274)表达量无明显变化。另外,抑制nestin基因表达,黄芩抑制K562细胞的生长抑制率由(65.7±3.6)%%提升为(73.0±7.1)%,但与单用黄芩组比较,不存在统计学差异(P=0.069)。结论:髓系白血病患者Nestin mRNA表达与高白细胞相关;下调nestin基因表达抑制白血病K562细胞增殖与侵袭,并诱导凋亡,其机制可能与HSP70,pro-MMP2,MMP2,pro-MMP9表达下调有关。提示nestin参与髓系白血病的发病过程以及其可能是一个潜在的治疗靶点。