研究背景及意义:新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）因具有良好的抗瘤效果和几乎无毒的优势,而成为肿瘤生物治疗的候选病毒株。NDV的抗瘤效果不仅与直接诱导肿瘤细胞的凋亡和自噬有关,还与NDV激活机体抗瘤免疫应答有关。自然杀伤细胞（natural killer cell,NK）是固有免疫系统的重要组成部分,它构成机体抗肿瘤免疫应答的第一道防线,同时,NK细胞还可间接调控获得性免疫应答来清除肿瘤细胞。研究表明,NDV能增强NK细胞抗瘤效应,它可能的重要机制之一是肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL）的上调表达。TRAIL是新近发现诱导靶细胞凋亡的配体分子,目前发现它的活性死亡受体存在于多种肿瘤细胞表面,因此TRAIL的杀伤功能具有肿瘤特异性。因而TRAIL的活化机制研究具有较重要的意义。肿瘤微环境中NDV促NK细胞TRAIL的活化机制并不清楚,我们课题组前期研究证实NDV可通过诱导NK细胞分泌g型干扰素（interferon-g,IFN-g）促进TRAIL上调表达来实现抗瘤效应的增强,然而IFN-γ抗体仅能部分抑制该效应,这提示可能存在不依赖IFN-γ的其它活化机制调控TRAIL,目前尚未见报道。我们推测NDV促NK细胞TRAIL的直接活化途径可能是不依赖IFN-γ的活化机制之一。因为NK细胞杀伤功能的调控有赖于表面的活化性受体与肿瘤细胞和病毒感染细胞表面配体的识别,其中,NKp46是NK细胞重要的活化性受体分子。目前体外研究发现,表达在感染细胞表面的NDV血凝素-神经氨酸酶（hemagglutinin-neuraminidase,HN）,可与NKp46结合,促进肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα,TNF-α）分泌。那么HN-NKp46途径是否是NDV促NK细胞TRAIL的直接活化途径成为本课题研究的研究内容。我们将以非依赖IFN-γ途径为切入点,以IFN-γ受体基因敲除的B6.129S7小鼠(以下简称IFN R^-/-小鼠)的脾脏NK细胞及IFN R^-/-NK细胞系为研究对象,展开NDV促NK细胞TRAIL的直接活化机制的研究,并初步探讨HN-NKp46途径活化TRAIL上调的NK细胞信号通路。这些研究将有助于拓展对NDV抗瘤的免疫活化机制的认识,为基于NDV-NK输注的抗肿瘤研究和临床治疗提供理论依据。目的:1.探讨NDV是否经非依赖IFN-γ途径活化小鼠NK细胞上调TRAIL表达。2.探讨HN-NKp46途径是NDV不依赖IFN-γ促NK细胞TRAIL上调的活化途径之一。3.初步探讨HN-NKp46途径活化TRAIL上调的NK细胞信号通路。方法:1.选用IFN-γ受体敲除的IFN R^-/-小鼠进行实验,利用免疫磁珠阴选法制备脾源性NK细胞;NDV和鼠源IFN-γ经体外刺激纯化的NK细胞或经腹腔注射体内刺激小鼠,经Western blot、ELISA及流式细胞术方法分别检测细胞膜型、分泌型TRAIL的量及TRAIL⁺NK细胞占NK细胞总群比值,观察NDV体内、外作用对NK细胞TRAIL表达的影响。然后采用ELISA方法检测NDV处理的体内和体外实验IFN-γ的量,观察NDV对NK细胞IFN-γ表达的影响。2.利用NDV及NDV的HN和F蛋白体外作用纯化的NK细胞,经Western blot、ELISA及流式细胞术方法检测TRAIL;利用基于ELISA法的体外结合实验检测NDV结合NK细胞的情况;进一步利用竞争结合实验和竞争结合干扰实验检测NDV、HN及F与纯化的NK细胞共培养对随后NKp46抗体结合的影响;随后利用唾液酸酶和HN抗体,观察HN-NKp46结合的干扰对HN活化NK细胞的影响,经Western blot、ELISA方法检测TRAIL;此外,利用ELISA法检测HN-NKp46结合的干扰对HN活化NK细胞IFN-γ的影响。3.HN与IFN R^-/-NK细胞体外共培养,利用Western blot法检测Syk、IκBα磷酸化以及HN-NKp46的阻断对Syk、IκBα分子磷酸化的影响;进一步利用Syk、NF-κB信号抑制剂干扰和siRNA干扰,经Western blot、ELISA方法检测TRAIL;利用Syk信号抑制剂和siRNA的干扰实验观察Syk是否影响下游NF-κB信号通路的活化,经Western blot方法检测IκBα分子磷酸化。结果:1.流式细胞术测定经免疫磁珠阴选法制备的脾源性NK细胞纯度>92%;IFN-γ受体正常时,NDV、IFN-γ均可体外促进细胞膜型和分泌型TRAIL的表达及TRAIL⁺NK细胞百分比的升高;IFN-γ受体缺失时,NDV仍可上调TRAIL及TRAIL⁺NK细胞比值,而IFN-γ不具有该效应;同时利用腹腔注射NDV的体内实验验证上述工作,结果发现NDV可促进IFN-γ受体缺失小鼠的脾源性NK细胞膜型TRAIL的表达和外周血TRAIL的量;IFN-γ受体的缺失,不影响NDV上调NK细胞IFN-γ的量。2.HN可体外促进IFN R^-/-NK细胞膜型和分泌型TRAIL的表达及TRAIL⁺NK细胞%的升高,而F蛋白不具有该效应;NDV或HN可结合到NK细胞,NKp46抗体或唾液酸酶的处理均可不同程度减少结合到NK细胞的NDV的量;NDV、HN可显著减少NKp46抗体与NK细胞的结合,F蛋白则不能,HN-NKp46的结合在识别早期存在HN剂量依赖性,且HN抗体可部分干扰NDV的竞争结合效应;唾液酸酶、HN抗体可明显减少NDV、HN体外促进IFN R^-/-NK细胞膜型和分泌型TRAIL的表达;HN-NKp46结合的受阻均可不同程度地减少NK细胞IFN-γ的量。3.HN可促进NK细胞Syk、IκBα的磷酸化活化,唾液酸酶、HN抗体可不同程度减少NDV、HN触发的NK细胞Syk、IκBα磷酸化激活作用;Syk信号抑制剂herbinmycin A、NF-κB信号抑制剂PDTC均可不同程度减弱NDV或HN促NK细胞的TRAIL上调;IFN R^-/-NK细胞分别干扰Syk、P65基因表达36H后,NDV或HN活化的NK细胞TRAIL上调可出现不同程度减少;无论是Syk信号抑制剂还是siRNA均可不同程度削弱HN触发的IκBα磷酸化激活作用。结论:本研究以IFN-γ受体敲除小鼠的NK细胞和IFN R^-/-细胞株为研究对象,围绕着NDV活化NK细胞上调TRAIL的非依赖IFN-γ途径开展研究。我们初步获得如下发现:1.NDV存在IFN-γ非依赖途径上调NK细胞TRAIL的表达。2.HN-NKp46途径是NDV不依赖IFN-γ促NK细胞TRAIL上调的活化途径之一。3.Syk、NF-κB信号通路在HN经IFN-γ非依赖途径上调TRAIL的表达中起重要作用。综上所述,在NDV抗肿瘤的NK细胞免疫激活机制研究中,NDV还可能循HN—NKp46—Syk—NF-κB途径激活NK细胞TRAIL表达,这些结果的发现提示利用NDV-NK联合治疗的潜在价值。