帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种常见的多发于中老年人的中枢神经系统退行性疾病,其主要病理改变为黑质多巴胺（dopamine,DA）能神经元的变性死亡以及残存神经元内路易小体的形成。目前,PD的发病机制仍不清楚。氧化应激作为自由基在体内产生的一种负面作用,被认为是导致PD的一个重要原因,其通过多种途径引起黑质DA能神经元的死亡。神经影像学检查以及尸检病理报告指出,PD病人早期铁选择性聚集在黑质,残存的DA能神经元内铁含量增高,表明铁代谢调控异常是导致PD中DA能神经元损伤的一个关键因素。细胞内铁稳态的维持,依赖于胞浆中的铁调节蛋白（iron regulatory proteins,IRPs）,其通过与铁代谢相关蛋白m RNA上的铁反应元件（iron regulatory elements,IRE）结合,调节这些蛋白的表达水平,从而维持细胞内的铁稳态。IRPs分为IRP1和IRP2两种形式,尽管IRP1和IRP2在机体广泛表达,IRP1主要表达在外周组织,而IRP2主要表达在中枢神经系统。IRP2-/-小鼠在6月龄时出现神经退行性改变,黑质、小脑、海马和尾核和白质有明显的铁沉积,而IRP1-/-小鼠不出现神经系统的异常表现,说明IRP2是调控脑铁代谢稳态的关键蛋白。但是,目前关于神经系统IRP2的表达调控机制,与细胞氧化应激损伤的关系,研究极少。对于该问题的阐明,将对了解PD黑质的铁聚集机制和发病机制提供新的思路。IRP2的蛋白表达调控途径有多种,包括转录水平、转录后水平、翻译水平和翻译后修饰水平,其中翻译后蛋白修饰是维持其稳定的主要途径,而泛素化修饰在蛋白质降解过程中发挥重要的作用。靶蛋白的泛素化需要特异的泛素连接酶（ubiquitin ligase,E3）,E3通过识别和结合特异的靶蛋白序列特异性地调节靶蛋白的降解代谢,经E3泛素化修饰的靶蛋白一般被26S蛋白酶体识别并降解。研究发现F-盒富含亮氨酸重复蛋白5（F-box and leucine rich repeat protein 5,FBXL5）是一种铁和氧依赖的E3泛素连接酶,在铁和氧充足时其活性和稳定性增强,催化IRP2的泛素化降解。但是,在PD中IRP2的表达变化是否与FBXL5相关尚不清楚。针对这一问题,本实验在SH-SY5Y细胞上,应用噻唑兰（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT）观察细胞活力的变化,流式细胞术检测细胞内活性氧类物质（reactive oxygen species,ROS）水平和线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,ΔΨm）的改变,实时荧光定量PCR检测FBXL5和IRP2的m RNA表达水平,免疫印迹法检测FBXL5和IRP2的蛋白表达水平,激光共聚焦显微镜技术检测细胞摄铁功能的变化,观察不同的氧化应激刺激,如H₂O₂、柠檬酸铁胺（ferric ammonium citrate,FAC）和硝普钠（sodium nitroprusside,SNP）,对IRP2蛋白表达水平的影响,并初步探讨其机制。研究结果如下:1.SH-SY5Y细胞经不同浓度的H₂O₂处理24 hrs后,应用MTT方法检测细胞存活率,结果显示细胞存活率随H₂O₂浓度的升高而降低,与对照组相比,20、30、50、200、300、500和1000μmol/L H₂O₂处理组细胞存活率分别下降10.2%、12.9%、13.7%、15.3%、21.2%、33.6%和38.6%,差别具有统计学意义（P<0.05）。2.200μmol/L和300μmol/L H₂O₂处理SH-SY5Y细胞24 hrs后,细胞内ROS水平分别升高了52.2%和87.3%,与对照组相比,差别具有高度统计学意义（P<0.01）。细胞的ΔΨm分别降低了1.7%和8.2%,与对照组相比,300μmol/L H₂O₂处理组差别具有统计学意义（P<0.05）。3.200μmol/L和300μmol/L H₂O₂处理SH-SY5Y细胞24 hrs,FBXL5的蛋白表达水平分别增高了20%和31%,IRP2的蛋白表达水平分别降低了44%和75%,与对照组相比,差别具有统计学意义（P<0.05）,而FBXL5和IRP2的m RNA水平无明显变化（P>0.05）。应用泛素-蛋白酶体抑制剂MG132预孵育后,200μmol/L和300μmol/L H₂O₂处理组细胞的FBXL5蛋白水平无明显变化,而IRP2的蛋白水平分别升高了49%和28%,差别具有统计学意义（P<0.05）。应用si-FBXL5预孵育后,200μmol/L和300μmol/L H₂O₂处理组细胞24 hrs,FBXL5蛋白水平分别降低86%和101%,而IRP2的蛋白水平分别升高39%和26%,差别具有统计学意义（P<0.05）。4.200μmol/L和300μmol/L H₂O₂处理SH-SY5Y细胞24 hrs,给予100μmol/L的Fe2+灌流,应用激光共聚焦显微镜观察细胞摄铁能力的变化,结果发现细胞内的荧光强度随时间而增强,说明细胞对Fe2+的摄取能力减弱,差别具有统计学意义（P<0.05）。5.SH-SY5Y细胞经不同浓度的FAC处理24 hrs后,MTT结果显示,10、30和50μg/m L FAC处理组细胞存活率无明显变化,100、300、500和1000μg/m L处理组细胞存活率随FAC浓度的升高而降低,与对照组相比,分别下降14.3%、26%、29.4%和38.5%,差别具有统计学意义（P<0.05）。10μg/m L和100μg/m L FAC处理SH-SY5Y细胞24 hrs后,细胞内ROS含量分别升高63.3%和94.8%,与对照组相比,差别具有高度统计学意义（P<0.01）。细胞的ΔΨm分别降低了12%和27%,与对照组相比,差别具有统计学意义（P<0.05）。细胞内FBXL5的蛋白水平分别升高了21%和37%,而IRP2的蛋白水平分别降低了28%和45%,差别具有统计学意义（P<0.05）。6.SH-SY5Y细胞经不同浓度的SNP处理24 hrs后,MTT结果显示,10、30、50和100μmol/L处理组细胞存活率无明显变化,300和500μmol/L组细胞存活率随SNP浓度的升高而降低,与对照组相比,分别下降21.9%和42%,差别具有统计学意义（P<0.05）。100μmol/L和300μmol/L SNP处理SH-SY5Y细胞24 hrs后,细胞内ROS含量分别升高了58.6%和82.3%,与对照组相比,差别具有高度统计学意义（P<0.01）。细胞的ΔΨm分别降低了43%和60%,与对照组相比,差别具有统计学意义（P<0.05）。细胞内FBXL5的蛋白水平分别上升了29%和40%,IRP2的蛋白水平分别降低了13%和47%,差别具有统计学意义（P<0.05）。上述实验结果表明,不同的氧化应激刺激,如H₂O₂、FAC和SNP,均可导致SH-SY5Y细胞内ROS水平升高,线粒体膜电位下降,造成细胞内的氧化应激状态,进一步引起FBXL5蛋白表达水平的升高,而IRP2蛋白表达水平降低,最终导致细胞摄铁能力的降低。而FBXL5和IRP2的m RNA水平均未变化,说明IRP2蛋白水平的降低并非由转录水平的因素影响的。而泛素-蛋白酶体途径的抑制剂MG132处理后,FBXL5蛋白表达量不变,而IRP2蛋白表达量明显升高,si-FBXL5处理后,FBXL5蛋白表达量显著降低,而IRP2蛋白表达量明显升高,说明MG132阻断了IRP2泛素化降解过程,此过程是由FBXL5介导的。本研究表明,氧化应激因素可以作用于泛素化修饰途径,从而影响IRP2的蛋白表达水平,为进一步深入揭示IRP2的中枢调控机制和在PD发病机制中的作用提供了新的实验依据。