目的：多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是发生于B淋巴细胞终末阶段的浆细胞恶性肿瘤，占所有恶性肿瘤的１％，血液系统恶性肿瘤的10％，在欧美国家已成为仅次于非霍奇金淋巴瘤的第二大常见血液系统恶性肿瘤。多发于中老年人，至今尚不能完全治愈。近年来，干细胞移植及万珂等新药的应用虽然在一定程度上改善了MM患者的预后，但是仍存在移植相关毒性、多药耐药等诸多问题。因此，寻求新的有效药物以延缓疾病进展、延长缓解期成为了目前的研究热点。唑来膦酸(zoledronic acid，ZOL)作为新一代的双膦酸盐类药物，通过抑制破骨细胞活性进而抑制骨吸收，并可逆转骨溶解病变的进展。目前已应用于恶性肿瘤溶骨性骨转移引起的骨痛、高钙血症、多发性骨髓瘤及肺癌等。国内外众多临床前研究提示，ZOL通过直接机制(肿瘤细胞黏附、侵袭、凋亡)和间接机制(血管生成、γδT细胞)发挥抗肿瘤效应。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)可使肿瘤细胞中组蛋白去乙酰化水平提高，诱导特定基因激活表达，导致肿瘤细胞的凋亡。LBH-589是氧肟酸盐类HDACi，在临床实验中，对多种实体瘤及血液系统肿瘤细胞均显示出抑制增殖和诱导凋亡的作用。在我科前期临床试验中，LBH-589对骨髓瘤细胞显示出较强的活性(IC50＜40nmol/L)。β2微球蛋白（bate2-microglobulin，β2-MG）是人类HLA抗原的一个亚基，主要表达于B细胞系统及单核细胞系统。MM患者可大量合成β2-MG并进入血液循环，故临床上可作为判断MM病情、治疗效果及预后的指标。本实验深入探讨了组蛋白去乙酰化酶抑制剂与唑来膦酸以不同方式联合应用对多发性骨髓瘤荷瘤鼠的作用，并通过细胞凋亡检测及血清β2微球蛋白（β2-MG）水平的定量以评价对多发性骨髓瘤的疗效，以期为临床治疗提供更多的手段及方法。方法：1细胞培养和传代人多发性骨髓瘤细胞株KM3细胞，用含10%灭活胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素的RPMI1640培养液，置于37℃，50mL/L CO2的培养箱中培养。2～3d传代1次，实验采用对数生长期细胞，台盼蓝染色拒染率95%以上。2建立KM3荷瘤裸鼠模型将处于对数生长期的KM3细胞用无血清的RPMI1640培养基洗涤2次后，重悬于1:1混匀无血清的RPMI1640培养基中，调整细胞密度为1×108/ml，每只裸鼠右前肢外侧皮下接种0.2ml(细胞数2×107/只)，共接种26只。3观察裸鼠成瘤率各组裸鼠以接种瘤细胞后15天为限，裸鼠右前肢外侧可见可测量肿块为标准，成瘤率=成瘤只数/总只数×100％。4实验动物分组成瘤裸鼠16只，随机分为4组(每组4只)：a.空白组；b.唑来膦酸组；c.LBH-589组；d.唑来膦酸与LBH-589联合用药组。各组以接种瘤细胞后第16天开始，a组不予用药，b组及c组每只裸鼠分别皮下注射浓度为0.1μmol/L的唑来膦酸及浓度为5nmol/L的LBH-589各0.2ml，d组每只裸鼠先后皮下注射浓度为0.1μmol/L的唑来膦酸及浓度为5nmol/L的LBH-589各0.2ml；每隔2d注射一次，共注射5次(上述各组剂量参照我科前期体外实验确定)。5抗肿瘤效果观察5.1观察荷瘤小鼠的一般情况及肿瘤的形态、体积变化：5.1.1观察荷瘤小鼠的一般情况：包括精神状况、皮肤光泽、活动度、饮食、饮水情况及体重变化。5.1.2药物5次注射完毕4周后断颈处死荷瘤小鼠，剥离肿块，测量肿块的长径及短径，并根据公式计算肿瘤体积和肿瘤生长抑制率(IR)：V=（长径×短径2）/2；IR=(V0-Vn)/V0×l00％(V0代表空白组的肿瘤体积，Vn为治疗组的肿瘤体积)；各组裸鼠肿瘤体积均取其平均值。5.2细胞凋亡检测将剥离的实体瘤组织解聚、分散，制备成组织匀浆，用流式细胞仪检测唑来膦酸单药组、LBH-589单药组及两药联合用药组的KM3细胞凋亡率。5.3应用放射免疫法(RIA)测定β2-MG水平。结果：1人KM3细胞裸鼠皮下移植瘤的成瘤：接种后4天于接种处，即右前肢外侧可见微小突起，约7-9天后可见注射部位出现可测量肿块，随时间推移肿物不断增大，接种成瘤率65.38％（17/26）。成瘤15天后移植瘤短径基本都在5mm以上，取其中肿物形态、大小相近的16只裸鼠用于实验分组。2实验动物的一般状况：a组裸鼠在实验后期日渐衰竭，精神萎靡，皮肤暗淡，饮食及饮水量较前明显减少，体重明显减轻。b组与c组裸鼠精神尚可，活动度略差，饮食、饮水量轻度减少。d组裸鼠精神状况、活动度、皮肤、饮食饮水量及体重均未见明显异常变化。3各实验组荷瘤小鼠的肿瘤形态及体积变化：a组随时间延长，肿瘤体积明显逐渐增大。b组及c组肿瘤体积稍有增大。d组随时间延长肿瘤体积未见明显增大，甚至稍有缩小。4各实验动物经治疗4周后计算肿瘤生长抑制率，结果：b、c、d组依次为71.97％、69.16%、94.27%。各治疗组与空白组之间差异有显著性，有统计学意义(P＜0.05)，单药组与联合用药组之间差异具有显著性(P＜0.05)。根据各组裸鼠肿瘤的一般情况及治疗后对肿瘤生长抑制率的计算结果表明，唑来膦酸及LBH-589可抑制多发性骨髓瘤KM3荷瘤裸鼠移植肿瘤生长，且两药有协同抑制作用。5应用流式细胞术检测KM3细胞凋亡：唑来膦酸单药组、LBH-589单药组及两药联合用药组应用于KM3荷瘤裸鼠后，均在G0/G1峰前出现了亚二倍体细胞峰，表明各组均出现了细胞凋亡，并且唑来膦酸联合LBH-589用药与二者单独应用相比，促进了KM3细胞的凋亡，差异有统计学意义(P＜0.05)。6各组荷瘤小鼠采用摘除眼球采血法，采集静脉血约0.6-1ml/只，应用放射免疫法(RIA)测定β2-MG水平。唑来膦酸组、LBH-589组及联合用药组β2-MG水平均较空白组有所下降，且两药联合较单药组下降水平更加明显，差异具有统计学意义(P＜0.05)。结论：1唑来膦酸及LBH-589均可抑制多发性骨髓瘤KM3荷瘤鼠移植瘤的生长，且二者联合用药具有协同作用。2唑来膦酸及LBH-589均可诱导KM3细胞凋亡，且二者联用具有协同效应。3唑来膦酸与LBH-589均可引起血清β2微球蛋白水平的下降，且二者联用具有协同作用。