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体细胞核移植技术在许多方面都有很大的应用前景,但目前核移植效率还普遍很低,人们对核移植重编程机制了解的也还不够全面。对母源因子的挖掘和研究可以增加人们对核移植重编程机制的认识,进而会提高核移植效率,促进核移植技术更广泛的应用。近几年来随着蛋白质组技术的发展,人们已经发现了许多卵中的母源蛋白,但如何从众多的母源因子中筛选出对胚胎发育,特别是对核移植重编程,有特殊作用的蛋白因子成为现在人们着重希望解决的问题。在前期工作中,我们发现大部分的猪体外成熟培养33 h的卵母细胞(33O)已经达到了核成熟,然而其核移植之后的克隆胚胎发育率却显著低于一般猪核移植所用的42h的成熟卵(42O)。这可能是因为42O中含有更多的有利于核移植重编程的母源因子,这就为我们针对性的挖掘对细胞重编程和早期胚胎发育起重要作用的母源因子提供了一个契机。在本研究中,我们拟通过对猪33O和42O的蛋白质组进行比较,发现33O和42O之间差异表达的蛋白,并试图从中发现一些与核移植重编程有关的母源因子,从而希望增加人们对核移植重编程机制的了解。主要研究结果如下:(1)首先我们利用定量蛋白质组学的经典技术路线——2D-PAGE+MALDI-TOF/TOF的方法构建了33O和42O的差异蛋白谱。对各10000枚去透明带的33O和42O中的总蛋白进行比较,最终发现了994对蛋白点。通过独立t-检验统计分析出了21个差异蛋白点。分离出的差异性蛋白点通过MALDI-TOF/MS分析,最终鉴定出18个差异蛋白,其中7个在33O中高表达,11个在42O中高表达。生物信息学分析发现这些差异蛋白的功能主要集中在卵母细胞成熟,胚胎发育,表观修饰,染色体重塑等这些方面。因此,这一差异蛋白谱对人们了解猪卵胞质成熟过程中的分子机制提供了宝贵的信息,并且为发现新的核移植重编程关键的母源因子提供了候选蛋白。(2)Vimentin(VIM)是差异蛋白谱中的一个母源蛋白,VIM在胞质成熟时继续合成,42O比33O含有更多的VIM。首先我们检测了VIM在早期胚胎中的表达模式。结果发现VIM在卵中高量表达,受精或激活后表达迅速下降,核移植后能够富集到供体细胞核中,说明VIM可能在核移植重编程早期发挥功能。接下来,我们在MII卵中注入VIM抗体来干扰其功能,核移植后(anti-VIM NT)发现核移植囊胚率与注Ig G组(Ig G NT)和非注射组(control NT)相比显著下降(12.24%v.s.22.57%,21.10%,P<0.05)。并且许多antiVIM NT胚胎阻滞于2细胞或4细胞期。但是,干扰VIM并不影响体外受精胚胎和孤雌胚胎的囊胚发育率。这说明母源VIM是核移植胚胎正常发育所必需的。另外我们发现在干扰母源VIM后,DNA双链断裂(DSBs)的标志——γ-H2Ax水平在克隆胚胎中表达显著升高,表明干扰母源VIM的克隆胚胎容易发生DSBs。并且干扰母源VIM后4-细胞克隆胚胎的P53的表达显著高于对照组。这些结果表明母源VIM在核移植重编程过程中能够防止DNA损伤,使P53基因维持低表达,从而有利于克隆胚胎发育。(3)EZH2是H3K27me3的甲基转移酶,也是一种母源蛋白,我们对它在猪核移植重编程中的影响进行了研究。我们对猪MII期卵母细胞和核移植后6 h克隆胚胎中的EZH2进行了免疫荧光检测,发现EZH2蛋白在MII期卵母细胞中高表达,核移植后6 h时,较多的EZH2蛋白富集到类原核中。向卵中注射EZH2的抗体来干扰其功能,核移植后发现干扰组2-细胞克隆胚胎的H3K27me3水平显著低于对照组,同时干扰组的克隆胚胎发育率显著比对照组要高(Ig G v.s.anti-EZH2,20.60%v.s.30.63%,P<0.05)。这说明猪克隆胚胎的H3K27me3水平可能异常高表达,干扰母源EZH2蛋白可能是通过降低了克隆胚胎的H3K27me3水平提高了克隆胚胎的发育。接下来,我们就对不同时期IVF和克隆胚胎中的H3K27me3的整体水平进行了检测,结果发现早期克隆胚胎的H3K27me3水平高于IVF胚胎,这可能与供体细胞PEF的H3K27me3水平高于精子和卵子密切相关。于是我们就采用了两种小分子抑制剂(GSK126和GSK-J4)分别抑制H3K27me3建立和擦除的酶(EZH2和JMJD3/UTX)对细胞和胚胎中的H3K27me3水平进行调控。结果发现0.75μM GSK126处理PEF细胞48h能够显著降低细胞的H3K27me3水平,同时处理组的囊胚率显著高于对照组(DMSO v.s.GSK126 0.75μM,21.99%v.s.31.82%,P<0.05);另外,虽然GSK-J4可以提高细胞的H3K27me3水平,但处理组和对照组的囊胚率没有差异。另一方面,在对胚胎进行处理时,我们发现0.1μM GSK126处理1-细胞克隆胚胎24 h能够降低克隆胚胎的H3K27me3水平,同时处理组克隆胚胎的囊胚率显著高于对照组(DMSO v.s.GSK126 0.1μM,21.99%v.s.31.33%,P<0.05),这与向卵中注射EZH2抗体的结果相似。而GSK-J4处理胚胎后提高了克隆胚胎的H3K27me3水平,同时降低了克隆胚胎的发育。最后,我们检测了降低细胞H3K27me3水平对i PS诱导效率的影响。结果发现,GSK126在源头细胞或i PS诱导过程中进行处理都可以提高i PS的诱导效率。这些结果说明,母源EZH2不利于猪核移植重编程,猪早期克隆胚胎的H3K27me3水平高于受精胚胎,通过抑制母源EZH2来降低克隆胚胎的H3K27me3水平能够促进克隆胚胎发育。在本研究中,我们通过对33O和42O的蛋白质组进行比较,发现了18个差异表达的蛋白,8个在33O中高表达,11个在42O中高表达。VIM在42O中高表达,在核移植重编程中能够防止DNA损伤,是猪克隆胚胎正常发育所必需的。另外,我们发现母源EZH2不利于猪核移植重编程,通过抑制EZH2来降低H3K27me3水平能够促进猪克隆胚胎体外发育和i PS诱导效率。