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胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells, ESCs)可以在体外进行自我复制式的增殖(自我更新),并且同时保持着能够分化成有机体各种类型细胞的能力,因此胚胎干细胞ESCs在再生医学领域具有着广泛的应用前景。前期的实验我们已经发现了转录因子Tfcp211 (Transcription factor CP2-like 1,Tfcp211)是LIF/STAT3信号通路的关键下游的靶基因,Tfcp211表达水平的变化能够大大地影响LIF/STAT3信号通路促进小鼠胚胎干细胞(mouse ESCs, mESCs)自我更新的功能,但是Tfcp211作用的具体分子机制国内外尚无报道。是否存在对于mESCs自我更新至关重要的、全新的转录因子。截至目前,在众多已揭示的STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3)下游靶基因中,只有下调Tfcp211的表达,才可以削弱STAT3信号促进mESCs自我更新的功能,从而诱导细胞分化,而至今鉴定出能够诱导mESCs分化的基因并不多。基于Tfcp211对mESCs自我更新的重要作用,结合本课题组多种高效的基因编辑工具,如慢病毒表达系统和PiggyBac Transposon系统等,有可能发现新的,并且对于维持mESCs未分化状态至关重要的基因。本课题通过初步筛选,发现MTA家族(包括MTA1,MTA2,MTA3)中MTA1和Tfcp211具有相互作用,其表达量的变化能够大大影响Tfcp211促进mESCs的自我更新能力。本课题具体的实验方案流程如下：首先是46C mESCs的培养,本课题所使用的46C mESCs,由剑桥大学Wellcome Truet Center研究所Austin Smith教授馈赠。46C mESCs培养在含有明胶包被的培养板里,培养基主要成分含有10%的胎牛血清和白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF),当细胞密度长至70%左右时,用胰酶进行消化。其次我们构建过表达Tfcp211的46C mESCs,主要分为以下几个过程：首先构建PB-Tfcp211载体：设计Tfcp211引物、获取目的基因Tfcp211、目的基因与PB-Tfcp211质粒的连接。构建好的载体即重组PB-Tfcp211空载体对照转化DH5a感受态细胞。挑取单克隆后扩大培养再抽提PB-Tfcp211质粒。得到PB-Tfcp211重组质粒的测序正确的,再使用脂质体转染法把PB-Tfcp211重组质粒转染46CmESCs,、此时过表达Tfcp211的46C mESCs构建完成,接着我们利用碱性磷酸酶(AP)染色和蛋白免疫印迹(Western Blot)方法鉴定Tfcp211转入46C mESCs的过表达情况。过表达Tfcp211的46C mESCs构建成功后,我们再挑选过表达PB-Tfcp211的46C mESCs的单克隆细胞株,然后鉴定过表达PB-Tfcp211的46CmESCs单克隆细胞株在无LIF条件下的自我更新能力,使用的检测方法为AP染色和qRT-PCR。为了寻找Tfcp211促进46C mESCs自我更新的潜在相互作用蛋白,我们参照了Debbie L.C在期刊cell stem cell上面报道的关于Tfcp211蛋白免疫共沉淀的质谱鉴定结果。我们首先选取MTA1,MTA2, MTA3三者作为我们的候选基因来研究其是否与Tfcp211存在相互作用来促进46C mESCs自我更新。首先我们使用RNA干扰技术来对MTA1, MTA2,,MTA3三者的表达水平进行调控,即下调MTA1.MTA2, MTA在46C mESCs中的表达,来看其是否影响46C mESCs自我更新能力。此时使用的46C mESCs均是Tfcp211过表达的46C mESCs单克隆细胞株。我们构建了MTA1,MTA2,MTA3的shRNA慢病毒载体：即针对Mta1、Mta2、Mta3三个基因设计RNA干扰引物,并重新连接至Plko.1-shRNA慢病毒载体。重组后的质粒Plko.1再转化DH5a感受态细胞,挑克隆扩大培养后进行重组质粒Plko.1-shRNA质粒抽提,测序鉴定正确的Plko.1-shRNA质粒用于下一步的病毒包装。病毒的包装使用Plko.1-shRNA质粒,包装细胞使用293FT细胞(其培养基的主要成分含有10%的胎牛血清)。转染使用的是lipofection LTX脂质体。病毒收取后感染Tfcp211过表达的46C mESCs。之后再使用AP染色和qRT-PCR鉴定Tfcp211过表达的46C mESCs的自我更新能力。最后使用免疫共沉淀技术鉴定Tfcp211和MTA1在mESCs中的相互作用。整个实验方案流程如上文所述,其主体分为两大部分,第一部分是Tfcp211基因过表达46C mESCs的构建,第二部分是在过表达Tfcp211的46C mESCs中降低MTA1,MTA2,MTA3的表达以检测它们是否可以影响mESCs的自我更新。我们发现只有在干扰MTA1的表达条件下,过表达Tfcp211的mESCs分化情况明显,即其自我更新能力下降了。qRT-PCR鉴定的结果如下：在干扰MTA1的表达的PB-Tfcp211的46C mESCs中,mESCs相关自我更新基因Nanog、Esrrb和Rexl的表达量下调,说明了干扰MTA1的表达后减弱了Tfcp211促进mESCs自我更新能力。相反的,mESCs相关的分化基因Gata6和sox17的表达量上升很多,说明了干扰MTA1的表达诱导了mESCs的分化。综合以上分析,干扰MTA1的表达可以影响Tfcp211促进mESCs自我更新能力。而免疫共沉淀的结果显示Tfcp211和MTA1在mESCs中有相互作用。