去甲肾上腺素诱导THP-1细胞差异表达上调基因cDNA文库的构建

来源 :南华大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jimmil
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目的:应用抑制消减杂交技术筛选去甲肾上腺素刺激THP-1细胞诱导的差异表达基因。进而对筛选所获得的两个差异表达基因CD137和IL-6进行检测。  方法:对培养的THP-1细胞给予应激浓度的去甲肾上腺素刺激(剂量10μmol/L,时间1h)后的差异表达基因进行抑制消减杂交,将消减产物扩增后克隆入pMD18-T质粒并转化大肠杆菌,建立了消减cDNA文库,经反向斑点杂交进一步筛选阳性克隆,随机选取5个差异表达的克隆进行测序,结果在GenBank中进行同源性比较分析。随后对筛选所获得的与炎症应答相关的CD137和IL-6进行初步研究。将应激浓度的去甲肾上腺素处理THP-1细胞0~24小时,运用逆转录-多聚酶链式反应检测CD137、IL-6 mRNA的表达,Western印迹检测CD137蛋白的表达,酶联免疫吸附试验检测IL-6蛋白的表达。  结果:SSH结果显示被克隆出的5条上调表达基因中,包括4条已知基因和1条新的基因表达序列标签。这些基因按功能可分为4组:一组与炎症应答的诱导和维持相关,一组与细胞信号转导相关,一组与细胞骨架重构相关,第四组编码一个未知功能蛋白,此编码蛋白的基因序列已经克隆出来,但据此推导出的蛋白功能尚待研究。对CD137和IL-6两个差异基因的检测证实10μmol/L的去甲肾上腺素作用THP-1细胞1小时后,其CD137、IL-6的mRNA和蛋白水平均上升(p<0.01)。  结论:应激浓度的去甲肾上腺素刺激THP-1细胞后能上调CD137、IL-6等基因的表达,可能影响单核细胞的功能。
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