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蚯蚓具有多种活性成分,其中蚯蚓镇痛成分的研究逐渐成为热点。目前已有报道从蚯蚓提取物中分离出具有镇痛活性作用的有效成分,但蚯蚓镇痛成分的镇痛作用机制未见报道。因此本研究旨在从对蚯蚓镇痛有效成分进行分离纯化,并对其镇痛机制进行初步探索。1、研究内容与方法(1)分离纯化实验：取新鲜蚯蚓,通过组织匀浆,低温离心,3KD和50KD超滤管截留,通过醋酸扭体法和热板法验证其镇痛活性,然后经过Sephadex G-50凝胶过滤层析,CM Sephadex C-50阳离子交换层析,高效液相色谱分离纯化,并用大鼠坐骨神经部分损伤模型对各级分离组分的镇痛活性进行验证筛选。(2)镇痛机制研究：通过外周部位镇痛实验(醋酸扭体法、甲醛致痛实验)、中枢部位镇痛实验(热板法、热浴甩尾法)、阿片受体依赖性实验、蚯蚓镇痛成分对疼痛模型大鼠单胺类神经递质影响实验、蚯蚂镇痛成分对疼痛模型小鼠NOS活性影响实验,探索蚯蚓镇痛作用及其机制。2、研究结果(1)经过匀浆、高速离心和超滤管截留的蚯蚓提取物具有明显的外周镇痛作用,然后经过Sephadex G-50凝胶过滤层析,分离到四个蛋白峰,通过大鼠坐骨神经部分损伤模型筛选出EAEC-I和EAEC-IV有明显的镇痛活性；将EAEC-I和EAEC-IV两种组分分别过CM Sephadex C-50阳离子交换层析,EAEC-Ⅰ分离出两种组分,EAEC-Ⅳ分离出三种组分,经过大鼠坐骨神经部分损伤模型验证EAEC-IA和EAEC-IVB具有明显的镇痛活性,再经过高效液相色谱层析,分别分离到四个波峰,大鼠坐骨神经部分损伤模型验证,EAEC-IA1和EAEC-IVB2具有明显的的镇痛活性。Tricine-SDS-PAGE蛋白电泳测EAEC-IA1和EAEC-IVB2分子量分别为21.6KD和28.2KD。(2)蚯蚓镇痛成分能显著抑制醋酸所致小鼠扭体反应和甲醛致痛模型Ⅱ相疼痛,且呈剂量依赖性,说明蚯蚓镇痛成分有明显的外周镇痛作用；蚯蚓镇痛成分能延长小鼠疼痛反应期和热浴小鼠的热潜伏期,但不呈显著性差异,说明蚯蚓镇痛成分有一定的中枢镇痛作用,效果不明显；通过阿片受体依赖性实验,蚯蚓镇痛成分镇痛作用不依赖阿片受体；蚯蚓镇痛成分可能通过降低疼痛模型大鼠血清中去甲肾上腺素(NE)和五羟色胺(5-HT)含量来发挥明显的外周镇痛,通过升高脑组织中NE和5-HT的含量发挥一定的中枢镇痛作用；蚯蚓镇痛成分能够显著降低疼痛模型小鼠血清和脑组织中一氧化氮合酶(NOS)活性,发挥镇痛作用。3、结论(1)本实验从蚯蚓提取物中分离纯化到了一种具有明显镇痛作用的成分EAEC-IA1和EAEC-IVB2,电泳测其分子量分别为21.6KD和28.2KD。(2)蚯蚓镇痛成分具有明显的外周镇痛作用,镇痛机制主要是通过减少外周5-HT、NE含量,降低外周NOS活性,减少NO生成发挥作用；蚯蚓镇痛成分还可以增加中枢5-HT,降低NE含量,提高NOS活性发挥一定的中枢镇痛作用,但效果不明显；蚯蚓镇痛成分的镇痛作用不具有阿片受体依赖性。