论文部分内容阅读
鸡传染性支气管炎(infectious bronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)引起的一种急性、高度接触性呼吸道传染病。IBV基因组极易发生变异,导致基因型、血清型、致病性和免疫原性多样化,不同基因型或血清型的毒株之间交叉保护效果不理想,生产上免疫失败时有发生,给养禽业带来较大经济损失。因此,及时了解掌握本地区IBV流行毒株的变异情况并筛选出具有良好免疫原性的毒株作为地方疫苗候选株,对IB防控具有很重要的现实意义。之前课题组完成了至2017年的广西IBV分离株的分子流行病学调查,以及对4株广西代表性IBV变异株致病性进行了研究,本研究在此基础上,继续对2018-2019年的广西IBV分离株进行跟踪研究,同时对此4株广西代表性IBV变异株的免疫原性进行研究,具体如下。一、2018-2019年广西IBV分离株S1基因序列分析应用鸡胚接种和RT-PCR技术对2018-2019年间广西疑似病鸡进行IBV的分离鉴定,并对分离株的S1基因进行扩增、测序以及相似性、进化树、重组、高变区、糖基化位点和S蛋白裂解位点分析。结果表明共分离鉴定到19个IBV分离株,此19株IBV的S1基因ORF为1611-1629 bp,编码537-543个氨基酸;分离株之间S1基因核苷酸相似性为66.2%-99.9%,分离株与疫苗株4/91、H120、QXL87、LDT3-A、LX4的S1基因核苷酸相似性分别为65.9%-78.9%、65.6%-83.2%、67.7%-96.0%、66.2%-99.1%、78.0%-99.1%。进化树分析表明,19株IBV分属于5个基因型:LX4型为优势基因型,占42.10%(8/19),LDT3-A型占26.31%(5/19),TaiwanⅡ型占15.78%(3/19),TaiwanⅠ型占10.52%(2/19),4/91型占5.26%(1/19)。重组分析表明,19株IBV中有5株出现基因重组,其中GX-NN190716、GX-NN190923、GX-NN191006和GX-GG190815四株重组株的主亲本均为GX-YL161022(QXⅡ型)株,次亲本均为CK/CH/LSC/99I株;GX-NN191213的主亲本为GX-GL(Taiwan型)株,次亲本为CK/CH/LSC/99I株。高变区分析结果表明,19株IBV三个高变区均发生了大量氨基酸的替换、插入和缺失。糖基化位点分析表明,19株IBV分别有9-18个N-糖基化位点;GX-YL191121株有2个O-糖基化位点,其余18株均无O-糖基化位点;S蛋白裂解位点分析表明,12株为RRFRR,6株为HRRRR,1株为HRRKR。二、4株代表性IBV变异株的免疫原性研究在本课题组前期研究基础上,对已进行了致病性试验的4株代表性广西IBV变异株GX-NN160421、GX-QZ170728、GX-QZ171023和GX-NN130048进行免疫原性和交叉免疫保护试验。将330只5日龄三黄鸡随机分为6组,分别为GX-NN160421组、GX-QZ170728组、GX-QZ171023组、GX-NN130048组、H120组和PBS组。GX-QZ171023组80只,其余各组50只。5日龄首免,19日龄(首免后两周)加强免疫。33日龄(加强免疫后两周)进行交叉攻毒。攻毒后5天宰杀部分试验组鸡,观察组饲养至47日龄(攻毒后14天)。以免疫后血清中的特异性抗体及中和抗体水平、外周血CD3~+、CD4~+、CD8~+T淋巴细胞含量、攻毒鸡临床发病率和死亡率以及气管、肾脏、肺脏的病毒载量、咽拭子和肛拭子排毒情况作为判断交叉免疫保护力的指标。IBV特异性抗体及中和抗体检测结果表明,GX-NN130048株灭活油乳剂疫苗能诱导较高水平的体液免疫应答;CD3~+、CD4~+、CD8~+T淋巴细胞百分含量检测结果表明,GX-NN130048株免疫后能引起鸡只出现高水平的细胞免疫应答;病毒载量检测结果表明,各组平均病毒载量为:GX-NN160421组(27)GX-QZ170728组(27)GX-NN130048组(27)H120组(27)PBS组;发病率、死亡率统计结果表明GX-NN130048株的免疫保护效果最好;观察组咽拭子、肛拭子排毒量检测结果表明,各免疫观察组排毒至5dpi,非免疫观察组排毒至7dpi,且各免疫观察组鸡的咽拭子、肛拭子排毒量均远低于非免疫观察组,与非免疫观察组差异极显著(P(27)0.01)。综合各检测指标,分离株GX-NN130048能诱导较高水平的细胞免疫和体液免疫,且攻毒保护效果较好,可作为研制本地区IBV疫苗的候选毒株。综上所述,本研究结果表明2018-2019年广西地区IBV流行的基因型有LX4型、LDT3-A型、Taiwan型和4/91型,其中优势基因型是LX4型;分离株GX-NN130048免疫原性较好,可作为研制本地区IBV疫苗的候选毒株。