第一部分micro RNA介导的内皮型一氧化氮合酶和胰岛素受体底物蛋白2之间的相互调节血管内皮作为血液循环中物质与血管壁之间的选择性屏障,既可以维持血管壁的完整性,还可以接受来自循环血液中各种机械和化学信号等刺激,产生多种细胞因子、生长因子等生物活性物质,在调节心血管的功能中起着关键作用。血管内皮是机体炎性反应的主要部位,内皮功能紊乱是多种心血管疾病如动脉粥样硬化发生发展的早期环节。而内皮型一氧化氮合酶(e NOS)作为其重要内皮功能的判断指标主要由内皮细胞表达,内皮细胞可通过释放一氧化氮(NO)发挥扩张血管、调节血压、控制血小板聚集、抗平滑肌细胞增殖等作用。e NOS的表达可受转录及转录后水平等多种修饰调节,当其功能出现障碍时,可造成NO生物利用度降低及氧化应激增加,导致或加重内皮功能障碍。竞争性内源RNA(competitive endogenous RNA,ce RNA)假说于2011年由哈佛医学院Pier Paolo Pandolfi研究小组提出,它是一种新的基因表达调控模式,是指不同m RNA之间可以通过相同的micro RNA反应元件(micro RNA response elements,MREs)达到相互调控的目的。已知mi RNAs可以通过结合m RNA导致基因沉默,而ce RNA可以通过MREs与mi RNAs结合从而影响mi RNAs导致的基因沉默,具有重要生物意义。ce RNA假说的提出赋予了m RNA和非编码RNA新的、更为广泛的生物学功能。各种类型RNA之间通过RNA-RNA对话所构成的调控网络在生物学和病理生理过程中发挥作用。eNOS的表达可受转录及转录后水平等多种修饰调节,但目前对于ce RNA是否参与调节e NOS m RNA及其潜在机制尚不清楚。我们运用生物信息学技术筛查到在人的内皮细胞中高度表达并且能够调控e NOS的mi RNAs为mi R-15b,mi R-16和mi R-30b,这三个mi RNAs共同调节的靶基因有1103个,均可称为e NOS的ce RNA,其中有15个ce RNA与e NOS之间存在着密切的疾病关联性,通过检测临床上患有心血管疾病病人的主动脉血管和股动脉血管样本的e NOS-ce RNAs表达并对其进行相关性分析,我们进一步确定了7个ce RNA与e NOS之间具有显著的相关性,分别为胰岛素受体底物蛋白1(IRS1),胰岛素受体底物蛋白2(IRS2),肾上腺素能受体β2(ADRB2),C反应蛋白(CRP),神经源性分化因子1(NEUROD1),溶质载体家族30成员8(SLC30A8)和泛素交联酶E2(UBE2E2),其中IRS2与e NOS的表达相关性最为显著。为验证IRS2与e NOS这对ce RNA之间的cross-talk,我们通过层流在转录水平上上调e NOS的表达或用e NOS的干扰RNA下调e NOS的表达,结果发现IRS2的表达随着e NOS的表达变化而变化,即层流使IRS2的表达上调,e NOS的干扰RNA下调了IRS2的表达,同样的,IRS2的干扰RNA也会引起e NOS的表达下调,然而e NOS和IRS2之间的相互调控在给予内皮细胞敲除Dicer这个mi RNAs的工具酶之后被阻断,说明e NOS和IRS2这对ce RNA之间的相互调节依赖于mi RNAs的桥梁作用。为进一步验证mi R-15b,mi R-16和mi R-30b这三种mi RNAs对e NOS和IRS2的调节是在转录后水平上进行的,我们构建了含e NOS和IRS2 3’UTR的荧光素酶报告基因的质粒,并将其与三种mi RNAs的类似物和抑制剂分别共转染到人的脐静脉内皮细胞(HUVECs)中,通过检测荧光素酶的活性发现这三种mi RNAs的类似物显著降低了荧光素酶的活性,而其抑制剂显著上调了荧光素酶的活性,从而验证了mi RNAs对其靶基因的转录后调控。同样的,这三种mi RNAs的类似物显著降低了e NOS和IRS2的m RNA和蛋白水平,其抑制剂显著上调了e NOS和IRS2的m RNA和蛋白水平。最后我们运用功能学实验验证了e NOS与IRS2在功能上的相互调节,即在内皮细胞中敲除IRS2会降低一氧化氮NO的释放,同样的,在内皮细胞中敲除e NOS也会影响胰岛素信号通路,抑制AKT的磷酸化水平,而这种降低或抑制均依赖于mi RNAs的桥梁作用。综上所述,我们预测到人的e NOS的ce RNAs,并在人血管内皮细胞和人的血管样本中确认IRS2作为主要的ce RNA,二者以mi RNAs桥梁,相互调节彼此的表达。因此,我们的研究提供了调控e NOS表达的新模式,并在一定程度上揭示了临床上多种心血管疾病如高血压和糖尿病之间密切联系的新机制。第二部分软骨寡聚基质蛋白COMP可以通过与integrinα5相互作用抑制内皮激活心血管疾病如动脉粥样硬化作为全球发病率和死亡率较高的疾病,严重威胁人类健康。内皮激活(内皮功能紊乱)作为多种心血管疾病如动脉粥样硬化发生发展的早期环节,对其具体机制的研究可为临床治疗心血管疾病提供新的靶点。近年来越来越多的研究集中在软骨寡聚基质蛋白COMP在心血管系统中的重要作用,但目前对于COMP是否影响内皮激活以及其潜在作用机制尚不清楚。因此,本研究的目的在于明确COMP是否影响内皮激活及其具体作用机制。软骨寡聚基质蛋白COMP,也可称为血小板反应蛋白TSP5,是一种主要表达在软骨系统和心血管系统的基质蛋白。多项研究表明COMP可以维持血管稳态;COMP的缺失可引起平滑肌细胞迁移增加;促进平滑肌细胞的钙化和动脉粥样硬化的发生和发展。考虑到内皮激活在多种心血管疾病中的重要作用,以及COMP在心血管中的保护作用,我们展开了一系列的研究以探索COMP是否影响内皮激活以及其具体作用机制。首先,在正常生理状态下,我们使用wild-type(WT),COMP全身敲除小鼠(COMP-/-)和平滑肌特异性过表达COMP的小鼠(SMC-COMPTg)三种小鼠分离其主动脉弓部小弯侧,弓部大弯侧和直部进行免疫荧光染色。检测内皮激活的标志物VCAM-1和ICAM-1,结果发现在内皮激活显著且易发动脉粥样硬化的血管弓部尤其是小弯侧VCAM-1和ICAM-1的表达在COMP-/-小鼠中显著高于WT小鼠,而在SMC-COMPTg小鼠中的表达较低。同样,相对于WT小鼠,COMP-/-小鼠主动脉血管中VCAM-1和ICAM-1的蛋白水平也显著增加,而SMC-COMPTg小鼠内皮激活的标志物则显著下调。在病理状态下,我们给予WT,COMP-/-和COMPTg三种小鼠行左颈总动脉部分结扎术并给两周高脂饮食在体模拟湍流状态,左颈总动脉免疫组化和免疫荧光染色结果发现相比WT和SMC-COMPTg小鼠,COMP-/-小鼠左颈总动脉内皮激活情况明显加重。体外细胞实验也证实COMP可抑制具有内皮激活和促动脉粥样硬化的湍流引起的内皮激活。整合素integrin作为一大类细胞膜受体蛋白,由α和β两个亚基通过非共价键连接组成异源二聚体,可与胞外基质或其它细胞表面的受体结合,介导细胞-细胞、细胞-细胞外基质之间的相互作用,通过由内到外(inside-out)和由外到内(outside-in)双向传递跨膜信号。目前报道的与内皮激活相关的integrin有α3β1,α6β1,α5β1,αvβ3和αvβ5,我们通过体内外的免疫共沉淀实验和双杂交实验证实COMP可通过其TYP3和C端结构域与integrinα5相互作用。进一步的体内外实验我们验证了COMP与integrinα5的相互作用可抑制FN和湍流引起的integrinα5的激活以及下游FAK和Src的磷酸化进而抑制内皮的激活。最后,我们运用生物信息学预测了COMP与integrinα5结合位点,并根据该结合序列在体外合成了含24个氨基酸的短肽,体内外实验均证实了此短肽可通过抑制integrinα5引起的内皮激活进而起到抗动脉粥样硬化的作用。综上所述,本研究发现细胞外基质蛋白COMP可通过其TYP3和C端结构域与integrinα5相互作用,抑制其激活进而抑制内皮的激活。最后我们根据COMP与integrinα5结合序列在体外合成的短肽可抑制内皮的激活,从而减缓了动脉粥样硬化的发展,具有一定的治疗作用。本研究揭示了COMP在内皮细胞中激活的新机制并为临床上治疗动脉粥样硬化提供了新的靶点。