为解决生物技术药物半衰期短的问题,各种长效化策略相继开发并成功应用于多种蛋白药物。聚乙二醇(PEG)修饰药物蛋白,能够显著延长半衰期,降低免疫原性,同时提高药物水溶性和稳定性。偶联PEG分子,可增大药物蛋白的水力学半径,从而减缓肾小球滤出速率,延长药物半衰期;另外一种方法是借助新生儿Fc受体(FcRn)介导的再循环途径,延长药物蛋白的半衰期。本论文针对这两种策略,开发了一种新型的巯基定点的PEG修饰试剂;拓展了白蛋白结合肽(ABD)融合表达的长效策略,并对两种重要的长效策略进行详细比较。巯基定点修饰对于实现高度选择性修饰、保证批次间重复性有着重要价值,已成为PEG修饰的重要方法。然而现有的巯基修饰试剂存在稳定性差、反应活性低、偶联产物易发生PEG脱落等问题。本论文利用邻苯二酚类化合物与巯基官能团的特异性反应,将邻苯二酚与PEG偶联制备一种新型的巯基定点修饰试剂(PEG-DAQ)。首先,利用有无游离巯基的同种突变蛋白,及巯基是否被N-乙基马来酰亚胺封闭的同一种蛋白确认了 PEG-DAQ的巯基定点选择性;通过对睫状神经营养因子(CNTF)、鞭毛蛋白突变体(CBLB502-Cys)和牛血清白蛋白(BSA)三种含巯基蛋白进行修饰反应,证实了该修饰剂的普适性;通过对比PEG-DAQ与常用的巯基修饰试剂PEG-MAL、PEG-VS的修饰效率,发现PEG-DAQ具有反应活性高的优点,其修饰率与PEG-MAL相近,且远高于PEG-VS;考察修饰试剂PEG-DAQ在不同pH条件下反应,发现在pH5.5-8.5之间均可以进行修饰反应,pH越高,修饰效率也越高。进一步,考察了修饰剂的稳定性,当PEG-DAQ在水溶液放置96h后,其修饰能力保持了几乎100%;与之对照的PEG-MAL,修饰能力仅有最初的70%。以CNTF作为模型蛋白,对修饰剂的应用做进一步研究。经PEG-DAQ修饰后分离纯化得到单修饰样品,经过圆二色光谱和荧光光谱确认,PEG-DAQ修饰的CNTF与原蛋白的二三级结构保持一致;考察修饰产物稳定性,发现PEG-DAQ修饰产物在37℃放置2周,单修饰产物存留率达93.5%;而PEG-MAL修饰产物仅保留71.2%。TF-1.CN5a.1细胞增殖实验证实了 PEG的亲水柔性链使CNTF的体外活性降低,但两种修饰试剂PEG-DAQ和PEG-MAL的修饰产物细胞活性没有显著差异,说明了 PGE-DAQ不存在明显的细胞毒性;SD大鼠实验证实了 PEG-DAQ-CNTF半衰期延长为原蛋白的3倍。因此,本论文的研究提供了一种新型巯基定点修饰试剂PEG-DAQ,这一修饰剂有着广泛的应用前景。人血清白蛋白(HSA)是血浆中含量最丰富的蛋白。HSA可以与FcRn受体结合,并借助其介导的再循环途径避免被胞内溶酶体水解,半衰期可达19天。治疗性蛋白可与HSA融合表达以此延长药物蛋白的半衰期。这种融合表达策略无需化学修饰及修饰后的纯化步骤,工艺简单,且产品均一性好。然而,与大分子量的白蛋白融合,一些治疗性的融合蛋白往往难以在原核表达系统中表达,需要真核表达系统,存在表达量低,成本高的问题。而小分子量的白蛋白结合肽(ABD)可以特异性的与白蛋白结合,借助白蛋白的稳定性和长效性,同样可以实现延长药物半衰期的目的。本论文利用这一原理,构建ABD与人睫状神经营养因子(CNTF)融合蛋白,通过原核体系表达制备ABD-CNTF,并与不同分子量的PEG修饰CNTF做对比,比较其药物作用的半衰期变化。结果发现,融合蛋白ABD-CNTF为可溶表达,表达量为90-100 mg/L发酵液;经过两步层析纯化,纯度为95%以上。SEC实验证实了ABD-CNTF保留了 ABD与HSA结合的能力,且结合可在数分钟(<10min)内完成;圆二色光谱和荧光光谱表明ABD-CNTF保留了原蛋白二、三级结构。TF-1.CN5a.1细胞增殖实验证明ABD-CNTF保留了 90%以上的原蛋白细胞活性;与之对照的是,PEG修饰CNTF损失了绝大部分细胞活性,PEG-40k-CNTF的细胞活性小于原蛋白的10%。最后,SD大鼠实验证实了 ABD-CNTF半衰期延长14倍,延长效果介于PEG-20k与PEG-40k之间。研究结果表明,ABD融合药用蛋白是一种低廉有效的制备长效蛋白药物的新方向。