海洋药源真菌等离子体诱变育种研究

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药源研究成本及门槛逐节攀升一直制约着新药研发的发展速度,等离子体技术作为一种新型菌种选育手段,为解决这一药源瓶颈问题带了希望。在越来越多的关于等离子体诱变育种技术的报道中将等离子体诱变育种技术应用于海洋药源微生物菌株育种或遗传改造的报道却不多,用在海洋药源真菌方面的更是鲜闻。本论文以具有抗肿瘤抗菌活性的产孢子海洋真菌Aspergillus unguis DLEP2008001为出发菌株进行小规模的等离子体诱变,在诱变菌株中随机挑选的51个菌落中复筛正变率达到了15.7%;活性增强20%以上的达到了3.9%,初步印证了等离子体诱变可以提高出发菌株中活性物质的产量。以等离子体、5-氟尿嘧啶、硫酸二乙酯、氯化锂为诱导剂作用于出发菌株Aspergillus unguis DLEP2008001,得到了致死率与诱导剂剂量之间的规律曲线。参照上述规律曲线制定复合诱变方案,得到3组较适宜诱变的复合条件。探索实验确定了8组较适宜诱变的条件,分别为等离子体单独诱变80s、DES1%6min+等离子体诱变9s、LiCl4.5%+等离子体诱变30s、LiCl3%+DES1%6min等离子体诱变40s、DES6%12min+等离子体诱变80s、LiCl6%、5-FU320μ g/mL、DES6%12min。本论文对出发菌株进行摇床发酵,并观察其次级次级代谢产物在不同发酵天数下的产量与丰富度的情况,最终确定7d为出发菌株的最佳发酵天数。在上述探索实验的基础之上本论文选取了6个适宜条件进行了大规模诱变。通过初筛(96孔板摇床发酵、滤纸片法抗大肠杆菌E.coliAB3027活性测试)初步确定了10株高产突变株,分别为2-1-F-10、6-20-18、3-9-D-2、2-1-D-4、8-5-F-11、1-3-C-6、6-10-C-7、2-4-C-9、4-10-B-4、2-7-A-7。通过复筛(发酵提取、滤纸片法抗大肠杆菌E.coli AB3027活性测试、TLC、生物自显影、半制备薄层层析、HPLC-DAD-MS)、质谱定性分析(分析软件为Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis B.06.00)及数据库检索(数据库:Dictionary of Natural Products on DVD2011),证明了等离子体诱变育种技术可以刺激菌株产生更多样化的新颖结构活性先导化合物。综上所述,本论文通过等离子体诱变海洋药源真菌Aspergillus unguis DLEP2008001,并初步研究突变株的次级代谢产物,表明等离子体诱变技术在海洋药源真菌选育方面具有一定的潜力,可能成为解决海洋药源研究的药源瓶颈问题的新途径。
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