猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)具有高度传染性,可引起仔猪呼吸系统障碍,怀孕母猪出现生殖障碍,其他年龄猪出现高热、腹泻;部分病猪耳发绀变蓝等主要症状的疾病。根据氨基酸序列分析,可将PRRSV分为欧洲型(PRRSV-1)和美洲型(PRRSV-2)两个血清型,在国内流行的毒株主要是美洲型。GP5蛋白是PRRSV编码最重要的结构蛋白,具有良好的免疫原性,可诱导机体产生中和性抗体。1.PRRSV GP5重组蛋白的原核表达根据本实验室PRRSV RD2007毒株公布的序列,通过软件预测了 GP5蛋白的信号肽区域和跨膜区,避开信号肽区域和跨膜区设计了两对引物,分段扩增目的基因,通过Overlap PCR拼接成完整的GP5基因。将完整的GP5基因克隆入pET-32a原核表达载体,并转化入E.coli DH5a,挑取单克隆进行培养和酶切鉴定,对鉴定为阳性的质粒送测序,结果与公布序列完全一致。将测序正确的质粒转化入E.coli BL21,测定最佳诱导表达条件。结果当温度28℃、诱导时间5h、IPTG浓度为1mM时表达效果最佳。对表达的GP5重组蛋白经SDS-PAGE分析,结果显示在30KDa处出现相应的条带,而pET-32a空载体对照无此条带。纯化浓缩后的蛋白经Western-blot验证,结果发现与PRRSV 阳性猪血清发生特异性反应,表明GP5重组蛋白成功获得表达。2.间接ELISA检测PRRSV GP5蛋白抗体方法的建立及初步应用将上述表达的GP5重组蛋白进行纯化,作为包被抗原,包被96孔ELISA酶标板,结合方阵滴定试验,成功建立了检测PRRSV GP5蛋白抗体的间接ELISA方法。进一步研究表明,该方法的最佳条件为,抗原包被浓度为1.25μg/mL,5%脱脂乳封闭液、封闭2h,待检血清稀释度为1:500、孵育45min,酶标二抗反应1h,显色20min。ELISA结果的判定标准:当OD450nm≥0.325时判定为阳性,OD450nm≤0.295时判定为阴性,OD450nm处于两者之间时判定为可疑,需重检。特异性试验显示,该方法与猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒的阳性血清均不发生交叉反应。敏感性试验显示,该方法能检出1:12800稀释的标准阳性PRRSV猪血清,批内和批间的变异系数均小于10%。对江苏省温氏猪场96份猪血清进行检测,该方法的PRRSV抗体阳性率为78.13%,与IDEXX公司的PRRSV ELISA抗体检测试剂盒的总体符合率为82.29%,与IFA的总体符合率为90.63%。间接ELISA检测PRRSV GP5蛋白抗体方法的建立,可为PRRSV流行病学的调查和疫苗免疫前后抗体水平的监测提供有效的手段。3.抗PRRSV GP5蛋白单克隆抗体的研制将上述纯化的GP5重组蛋白与适量的佐剂乳化后免疫6-8周龄的BALB/c小鼠,三次免疫后测定小鼠血清抗体效价,取抗体效价高的小鼠加强免疫,加强免疫后72-96h,采取脾脏淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。以感染PRRSV RD2007毒株的Marc-145细胞作为抗原,对融合成功的杂交瘤细胞进行间接免疫荧光筛选和亚克隆。结果筛选了五株能分泌抗GP5蛋白单抗的细胞株,分别命名为PRRSV-2H3、PRRSV-1G8、PRRSV-2E9、PRRSV-2D5 和 PRRSV-2F9,Ig 亚类鉴定结果均为 IgG1。腹水的IFA抗体效价为1:1600～1:6400。WB的结果显示,这5株单克隆抗体均能与纯化的GP5重组蛋白反应。进一步研究表明,这5株单抗与GP5蛋白的识别位点均位于130～201aa。抗PRRSV GP5蛋白单克隆抗体的成功研制,为下一步研究PRRSV主要结构蛋白的功能奠定重要的基础。