目的T细胞应答为主的细胞免疫在HBV感染的发生发展中发挥着重要并且复杂的作用[1-2]。一方面,它们通过杀伤HBV感染的肝细胞来清除病毒,促进感染消退,疾病痊愈,另一方面,它们可以通过旁临细胞效应或者耗竭对正常的肝脏组织形成损害,从而造成慢性炎症,进而发展成为肝硬化甚至肝癌[3-4]。T细胞的抗原受体库数量可达1×1011到1×1014,并且具有非常丰富的多样性,其在整体水平表现出来的状态反应了机体对于多种抗原的潜在应答能力,同时也反映了机体曾经的抗原暴露史和免疫调节的结果。而在慢性乙型肝炎的病程中,HBsAg常常作为病人是否痊愈的标志,其与乙肝病毒的cccDNA呈密切的联系,而cccDNA又是介导乙肝复发的关键因素。因此,研究HBsAg转阴相关的T细胞免疫库谱意义深远[5]。高通量测序技术的应用极大地提升了对于大样本数据的获取能力,通过对病人外周血T细胞中TCR mRNA进行测序,可以高效准确地了解T细胞库谱的特征。本研究就通过对慢性乙型肝炎患者与健康对照外周血中T细胞受体β链(TCRβ,TRB)序列分析比较,探讨如下问题:1.阐述HBV慢性感染时CD8+T细胞受体库(TCR repertoire)的特征;2.寻找HBsAg血清学转换相关的CD8+T细胞受体库的特征,以期作为预测临床疗效以及评价治疗效果的指标。方法1.选择HBV感染病人及健康对照,收集其外周血,采用密度梯度离心法获取淋巴细胞,液氮冻存。常规治疗76周并随访检测病毒学和生化指标,挑选HBV感染组61人及健康对照组40人进行对比研究。取出入组者的冻存的细胞,复苏后提取RNA并将其逆转录为cDNA,采用多重PCR法对其TCRβ链CDR3区(TRB-CDR3)序列进行扩增及纯化,采用高通量测序技术获得序列信息后,将其输入IMGT数据库比对,通过组间对照,获得HBV慢性感染病人外周血TRB-CDR3免疫组库(immune repertoire)的特征,分析其多样性及其他特征,并且找到HBV感染相关的T细胞克隆型。2.选择HBV感染病人及健康对照,收集其外周血,采用密度梯度离心法获取淋巴细胞,液氮冻存。常规治疗76周并随访检测病毒学和生化指标,挑选HBsAg未转阴组27人和转阴组34人进行对比研究。取出入组者的冻存的细胞,复苏后提取RNA并将其逆转录为cDNA,采用多重PCR法对其TCRβ链CDR3区(TRB-CDR3)序列进行扩增及纯化,采用高通量测序技术获得序列信息后,将其输入IMGT数据库比对,通过组间对照,分析人外周血TRB-CDR3多样性等特征与HBsAg转阴之间的关系,探索TCR repertoire是否能够作为HBsAg转阴的预测标志物。同时,为了研究不同治疗方式导致HBsAg转阴时TCR repertoire的差异,以期探索免疫组库是否能作为患者选择治疗方法时的参考标准,我们将HBsAg转阴组进一步分成了自发转阴组和IFN治疗转阴组,以研究包括未转阴组在内的三组病人的TCR repertoire情况。另外,为了初步探讨TCR repertoire作为HBsAg转阴预测标志物的机制,我们对两组病人的T细胞进行了体外培养,检测抗原特异性T细胞的功能;并且,对外周血总T细胞进行了RNA测序,检测其基因表达情况。结果1.HBV慢性感染患者组的reads数明显高于健康对照;慢性感染组的TCR组库多样性明显低于健康对照组;虽然CDR3的平均长度没有差异,但是感染组的某些个体的CDR3长度呈现偏态分布;N端去除或者添加的碱基数没有差异;V、J基因的取用频率以及其组合没有差异。此外,我们找到了若干HBV感染相关的TCR克隆型,这些克隆在很多HBV慢性感染的机体中共同存在,而不存在于健康个体中。2.HBsAg转阴组相较于未转阴组,其CDR3的长度,插入碱基数量,V、J基因之间碱基总长度(ndn size),V、J基因的取用分布以及其组合等均无差异,但是从CDR3的分布图可以看出,HBsAg转阴组呈现正态分布,而未转阴组呈偏态分布。HBsAg转阴组的免疫组库多样性明显高于未转阴组。通过比较发现,自发转阴组和IFN诱导的转阴组之间各项指标均无差异。克隆型聚类分析也显示,这两组的克隆型基本类似,都明显区别于未转阴组和健康对照组。对各转阴组以及未转阴组的抗原特异性T细胞的功能分析没有发现统计学差异。但是对于总的T细胞进行转录组分析,发现HBsAg转阴组的T细胞活化以及效应相关基因的表达高于未转阴组。结论1.相较于健康对照,HBV慢性感染患者体内的T细胞长期受到抗原刺激,因此处于增殖状态,导致其CDR3长度呈现偏态分布,免疫组库的多样性也发生明显降低。经过长期的抗原刺激,其体内的确存在有HBV感染相关的克隆型。有些克隆型在HBV感染病人中广泛存在,其在病人群体中的分布率甚至高达59%。2.HBsAg转阴组的多样性明显高于未转阴组,并且其CDR3长度分布几乎全部处于正态分布,这提示其增殖水平低于未转阴组,可能是由于感染初期该组患者发生了快速有力的免疫反应,及时清除了HBV,使得整体的炎症水平明显降低所致。通过比较各种repertoire指标和克隆型聚类分析,未发现IFN诱导转阴组和自发转阴组有差异,因此,我们认为在免疫组库水平上不能分辨二者的差异。就目前的检测手段及指标来看,免疫组库检测尚不能作为患者选择治疗方式的参考指标。对抗原特异性T细胞的功能检测结果可知,各治疗方式致HBsAg转阴组及未转阴组患者之间的抗原特异性T细胞的功能无明显差异,这提示可能有其他机制参与转阴过程。总T细胞的RNA sequencing检测提示,就T细胞总体来看,转阴组患者体内的T细胞功能应该更加活跃。