论文部分内容阅读
由肝片吸虫(F.hepatica)引起的疾病是一种全球性的人畜共患寄生虫病，也是我国危害最重的牲畜寄生虫病之一，用疫苗特别是基因工程疫苗来防治肝片吸虫病是一种新战略。分枝杆菌属卡介苗(Bacille Calmette-Guerin，BCG)集佐剂与抗原于一身，在BCG中表达外源疾病抗原基因，从而研制BCG活疫苗或多价疫苗已成为国内外新型疫苗特别是寄生虫疫苗研究的重点和热点。本文叙述了肝片吸虫主要保护性抗原基因FH3重组质粒的构建及其在卡介苗中的表达的研究工作，为开展重组卡介苗肝片吸虫疫苗的研究奠定基础。 利用本实验室构建的肝片吸虫cDNA文库，从中筛选出具有较强免疫原性的FH3抗原基因，将其亚克隆到pUC18上，命名为pUC18/FH3。提取质粒pUC18/FH3，用EcoR Ⅰ酶切后回收FH3片段，测定FH3片段的碱基序列，其大小为0.89kb，两端均含有EcoR Ⅰ限制性酶切位点。大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒载体pMV261同样用EcoR Ⅰ酶切并去磷酸化，经T4DNA连接酶连接后，FH3片段以正确相位插入到pMV261中，构建了含有肝片吸虫保护性抗原基因的重组穿梭质粒pMV261-FH3。重组质粒通过电转移法转化卡介苗，电转化条件为6.25kv/cm，25μF，1000Ω，并分别研究了影响卡介苗电转化的几个主要因素，如培养基中甘氨酸浓度、卡介苗菌龄、细胞浓度及DNA用量、电击时电场强度及电阻等，得到了在本实验中卡介苗电转化的最佳条件。经电转化后获得了具有卡那霉素抗性的重组卡介苗，提取卡介苗总DNA，斑点杂交实验证明重组卡介苗中含有此抗原基因。45℃下热诱导FH3基因在重组卡介苗中的表达，并对基因表达产物进行SDS一PAGE分析，结果显示，重组卡介苗总蛋白在约22kD处有新的蛋白带出现，符合FH3基因序列表达产物大小。