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研究背景高尿酸血症（hyperuricemia,HUA）是一种体内嘌呤代谢紊乱所致的血尿酸水平异常增高的代谢性疾病。流行病学调查研究表明,HUA发病率呈逐年升高和低龄化趋势。血尿酸水平的升高与肾脏疾病、高血压、心血管疾病及血脂代谢紊乱等呈正相关,及早采取干预措施控制尿酸水平能有效阻止HUA的发生和由此产生的多系统多组织损害。近年来随着对人体肠道微生物研究的深入,肠道菌群的异常代谢已被证实在HUA及其肾脏病变中发挥重要作用。机体产生的尿酸主要经过肾脏和肠道排泄,肠道正常菌群尿酸氧化酶表达高,能将尿酸氧化降解成尿囊素排出体外。肠道菌群紊乱引起肠道尿酸排泄障碍是导致HUA的重要病因之一。中药水煎液通过口服进入机体,直接与胃肠道菌群发生相互作用,推测中药可能通过调节肠道菌群,纠正菌群紊乱,发挥对疾病的干预作用。研究发现中药活性成分可通过调节HUA引起的肠道菌群失衡和代谢紊乱来改善HUA症状。因此肠道菌群可能是干预或治疗HUA的潜在新靶点。临床报道萆薢分清饮能治疗HUA等尿酸相关性疾病[1-3],但具体机制研究尚属空白。研究目的采用C57BL/6雄性小鼠,利用腺嘌呤联合氧嗪酸钾复制肾阳虚型HUA模型,观察萆薢分清饮对肾阳虚型HUA小鼠血浆尿酸水平、肾脏炎症和纤维化、肠道菌群失调与机体水液代谢紊乱的调节作用,初步揭示肾阳虚型HUA尿酸代谢异常的生物学基础和水液代谢紊乱机制,探究萆薢分清饮干预肾阳虚型HUA的可能作用机制。研究方法本实验主要分为两大部分选取健康SPF级雄性C57BL/6小鼠24只,随机分为4组:空白对照组（Control组）;模型组（HUA）组;萆薢分清饮组（BXFQY组）（Bi Xie Fen Qing Yin,BXFQY）;模型给药组（HUA+BXFQY组）。HUA组和HUA+BXFQY组采用37.5 mg/kg腺嘌呤和100 mg/kg氧嗪酸钾混悬液灌胃,每日1次,连续3周。BXFQY组和HUA+BXFQY组使用BXFQY水煎液灌胃,每日1次,持续3周。各组小鼠均给予正常动物饲料和灭菌蒸馏水。观察记录小鼠一般情况（宏观表征、体重、饮食和饮水量）,通过血浆尿酸水平结合宏观表征对模型小鼠进行评价。结合血浆尿酸、肌酐和尿素氮水平、体重变化、肾脏脏器指数等指标,评估BXFQY对肾阳虚型HUA的干预作用。采用实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹、免疫荧光/组化技术等细胞生物学手段检测模型小鼠水液代谢、肾脏炎症与纤维化,肠道炎症和细胞紧密连接相关基因m RNA或蛋白水平变化,深入探索BXFQY对肾阳虚型HUA小鼠肾脏和肠道损伤,水液代谢以及尿酸排泄转运的调节机制。采用16S r DNA测序技术检测各实验组小鼠肠道菌群变化,运用生物信息学手段分析比较BXFQY干预前后肾阳虚型HUA小鼠肠道菌群多样性、丰度及代谢功能等变化。采用液质和气质联用技术测定小鼠粪便中短链脂肪酸、胆汁酸和色氨酸代谢产物吲哚的含量,探讨BXFQY对肠道菌群关键代谢产物的调控作用。为了验证肠道菌群是否参与介导BXFQY对HUA的干预作用,第二部分实验复制经抗生素处理的肾阳虚型HUA伪无菌小鼠模型,观察BXFQY对肠道菌群耗竭小鼠HUA是否能继续发挥干预作用。24只小鼠随机均分至4个实验组,具体分组如下:空白对照组（Control组）、模型组（HUA组）、模型抗生素组（HUA+ABx组）（抗生素混合物,Antibiotic mixtures,ABx）;模型抗生素给药组（HUA+ABx+BXFQY组）。HUA+ABx组和HUA+ABx+BXFQY组小鼠在给予腺嘌呤、氧嗪酸钾和/或中药水煎液之前,使用ABx连续处理8周以去除肠道菌群。Control组给予正常饮食和自由饮水,持续11周。HUA组、HUA+ABx和HUA+ABx+BXFQY组给予正常饮食11周,其中最后3周接受腺嘌呤联合氧嗪酸钾灌胃复制肾阳虚型HUA小鼠模型。此外,HUA+ABx+BXFQY组从第9周开始还接受BXFQY水煎液灌胃干预,持续3周。HUA+ABx组和HUA+ABx+BXFQY组小鼠以自由饮水方式接受ABx（1.0 g/L氨苄青霉素、1.0 g/L硫酸新霉素、0.5 g/L万古霉素和0.5 g/L甲硝唑,溶于无菌水中）共11周。第8周结束时检测两组小鼠肠道内微生物群,发现几乎所有细菌和主要属水平细菌丰度都已无法检测到,表明HUA+ABx组和HUA+ABx+BXFQY组小鼠的肠道菌群已被顺利耗竭。观察记录小鼠的一般情况,通过血浆尿酸水平和行为表征对肠道菌群耗竭小鼠肾阳虚型HUA模型进行评价,结合肠道屏障功能和肾脏炎症、纤维化、水液代谢指标再次评估BXFQY水煎液对模型小鼠的干预作用。为了更好地阐明中药水煎液的作用机理,采用液相-质谱分析BXFQY水煎液成分,测定水煎液中总多糖、总黄酮、总皂苷和总多酚含量。后续其他检测方法同第一部分实验。研究结果第一部分实验结果1.模型评价结果:HUA小鼠精神状态逐渐萎靡,毛发由光滑柔顺转变为凌乱欠光泽,干结泛黄,部分毛发有白化倾向,小鼠喜扎堆蜷卧。经腺嘌呤联合氧嗪酸钾灌胃3周诱导的HUA小鼠,出现体重减轻,饮水量增多,尿频,尿液清稀量多,排便困难,大便干结等症状,且伴随频繁拱背竖毛、抓力减低、毛色无华、喜蜷缩静卧、抓取激惹反应力下降、活动度减低等表现。HUA小鼠血浆尿酸水平相对Control组显著上升（P＜0.01）。2.萆薢分清饮干预效果:HUA+BXFQY组小鼠血浆尿酸、肌酐、尿素氮水平及肾脏脏器指数显著下调（P＜0.01或P＜0.05,与HUA组相比）,体重减轻、饮水量增多、尿频、尿液清稀量多、排便困难、竖毛、拱背、喜蜷卧、活动度减低等症状也得到明显改善。3.肾脏炎症和纤维化,水液代谢及尿酸排泄相关指标变化:组织学染色结果显示Control组肾脏组织形态结构正常,无明显炎症细胞浸润。HUA组肾脏肾小管明显扩张,上皮细胞脱落伴间质炎性细胞浸润和蓝色胶原纤维沉积。BXFQY处理后,HUA+BXFQY组肾小管扩张程度明显缓解,巨噬细胞浸润减少,间质内胶原纤维沉积区域面积明显缩小。实时荧光定量PCR结果显示,HUA组促炎因子和纤维化相关基因m RNA表达水平明显升高（P＜0.01,与Control组相比）;水煎液干预后,HUA+BXFQY组促炎和纤维化因子转录水平相对HUA组明显降低（P＜0.05）。Western blot结果显示腺嘌呤联合氧嗪酸钾诱导可致p-P38、p-ERK、β-catenin和NLRP3/IL-1β信号通路蛋白高表达,AQP3和ENa C-γ蛋白低表达。BXFQY灌胃处理后,HUA+BXFQY组中上述蛋白多呈现反向变化。肾脏尿酸排泄转运蛋白方面,HUA组Abcg2和Oat1 m RNA表达明显低于Control组（P＜0.01）,给予水煎液灌胃后,二者表达有升高趋势（P＞0.05）。4.肠道炎症、屏障损伤、水液代谢和尿酸排泄相关指标变化:HUA小鼠肠道促炎基因m RNA表达水平显著升高,且大部分被BXFQY逆转下调至低水平。模型小鼠在接受BXFQY处理后,Zo-1和Mucin-3 m RNA表达明显上调（P＜0.01）,Mmp-9的上调趋势被显著抑制（P＜0.01,与HUA组相比）。水液代谢基因方面,HUA组肠道AQPs表达明显高于Control组。经BXFQY干预后,HUA+BXFQY组AQPs基因m RNA恢复低表达水平,Abcg2转录恢复高表达水平（P＜0.01）。5.肠道微生物群检测:（1）HUA组菌群丰富度Chao1指数和多样性PD whole tree指数均显著降低（P＜0.05,与Control组相比）;BXFQY灌胃给药后,HUA+BXFQY组菌群丰富度和多样性指数显著上升（P＜0.01,与HUA组相比）。PCA和NMDS结果显示实验组小鼠肠道微生物群聚类后为四个不同的簇,提示各实验组肠道菌群间有较好区分度。HUA疾病状态下许多细菌丰度发生了明显变化,BXFQY干预后,大多数细菌丰度都恢复到接近Control组水平。6.菌群代谢产物检测:HUA小鼠粪便中乙酸、丙酸、丁酸含量出现系统性下降（P＜0.05或P＜0.01,与Control组相比）。HUA小鼠粪便中吲哚含量升高（P＜0.01）,在BXFQY干预给药后降低。模型小鼠粪便中总胆汁酸,初、次级胆汁酸水平明显上升（P＜0.01）,BXFQY干预后,三者含量相对HUA组明显下调（P＜0.01）。HUA小鼠粪便中CA、DCA、T-α-MCA、T-β-MCA、TCA、TUDCA和UCDCA为高水平表达（P＜0.05或P＜0.01）。BXFQY处理后,各组分胆汁酸水平更趋向于接近Control组。7.功能预测与相关性分析:通过PICRUSt分析对肠道微生物群落进行系统发育调查,筛选出基因覆盖率高的11条通路。HUA组果糖和甘露糖代谢和弓形虫代谢途径明显上调;丙酸、丁酸代谢,核苷酸切除修复,D-精氨酸和D-鸟氨酸代谢,甲烷代谢和色氨酸代谢途径明显下调。HUA+BXFQY组明显上调的代谢途径有叶酸合成,脂肪酸的生物合成和D-精氨酸和D-鸟氨酸代谢;明显下调的代谢途径有果糖和甘露糖代谢,甲烷代谢和胰岛素信号通路。Spearman相关性分析结果显示肠道细菌属水平上的变化大多与尿酸分解,吲哚、胆汁酸代谢、炎症因子和肠黏膜屏障完整性基因呈正相关或负相关。第二部分实验结果1.模型评价结果:正常小鼠经腺嘌呤联合氧嗪酸钾灌胃复制模型后,表现严重竖毛、拱背,喜扎堆蜷卧症状,伴随抓取激惹反应程度明显下降、活动度减低。HUA+ABx组小鼠血浆尿酸水平相对Control组显著上升（P＜0.05）。肠道细菌q RT-PCR结果显示小鼠口服ABx饮水8周后,几乎所有细菌和主要属水平细菌都无法被检测到,提示小鼠的肠道菌群被耗竭。2.肠道菌群耗竭小鼠HUA干预实验:肠道菌群被耗竭后,BXFQY无法降低HUA模型小鼠血浆尿酸及肌酐水平,对肾脏炎症与纤维化病变失去改善作用。肠道H＆E染色、阿新蓝染色和WGA-FITC染色结果显示水煎液无法修复肠道黏膜屏障损伤,缓解结肠糖蛋白、粘蛋白含量减少。肠道q RT-PCR结果表明BXFQY对肠道菌群耗竭HUA模型小鼠肠道炎症与氧化应激分子上调,细胞紧密连接蛋白表达的下调无法产生调节作用。研究结论1.HUA小鼠表现出形寒肢冷,精神萎靡不振,小便清长、活动度减低等“肾阳虚”症状,伴随血浆尿酸水平显著升高和小便频数、大便干结等肾脏、肠道水液代谢紊乱表现,提示肾阳虚型HUA小鼠模型复制成功。2.BXFQY能显著改善肾阳虚型HUA小鼠的一般症状和表征,降低血浆尿酸水平并改善肾功能。3.经BXFQY处理后,肾阳虚型HUA小鼠肾脏炎症、纤维化和水液代谢紊乱得到有效缓解。4.BXFQY通过抑制NLRP3炎症小体活化,阻断肾小管上皮细胞EMT进程,达到缓解HUA小鼠肾脏炎症与纤维化损伤目的。5.BXFQY对肾阳虚型HUA小鼠肠道炎症和黏膜屏障损伤、尿酸肠道排泄以及水液代谢紊乱具有一定调节作用。6.BXFQY通过纠正肾阳虚型HUA小鼠肠道菌群紊乱,重塑肠道菌群结构,调节胆汁酸、吲哚等菌群代谢产物异常变化,发挥抗HUA作用。