前言：CDC25磷酸酶是一种双重特异性蛋白磷酸酶，在裂殖酵母细胞中首次被发现，可以在G2/M期转变中直接激活CDC2激酶，并以剂量依赖性的方式启动有丝分裂，因此被认为是有丝分裂的启动者。迄今为止，人们已经从哺乳动物细胞中鉴定出三种相关的CDC25基因产物，分别称为CDC25A，CDC25B和CDC25C。他们均为双特异性磷酸酶，包含高度保守的催化结构域，能对磷酸酪氨酸和磷酸苏氨酸进行去磷酸化，由此激活他们的生理底物CDKs。由于他们都包含蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase，PTP)特征基序C(X)5R，因此CDC25磷酸酶属于PTP超家族。　　 CDC25B是CDC25蛋白家族的最重要成员，贯穿细胞周期的各阶段，由于在不同时期定位于细胞内不同的位置，故其在细胞周期各期转换中起核心作用，在细胞有丝分裂过程中发挥重要作用。CDC25B磷酸酶在G2/M期转换过程中可使CDC2激酶去磷酸化，肩负激活CDK1(cyclin dependent kinases1)-cyclinB的重大责任，是早期有丝分裂的启动因子，同时也是卵母细胞恢复减数分裂的核心调控因子。　　 蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)是cAMP依赖性蛋白激酶，广泛参与调节多种真核细胞的细胞周期进程。有文献报道，在爪蟾卵母细胞成熟过程中，PKA通常作为一种负性调节因子发挥作用。目前研究表明，在爪蟾卵母细胞中CDC25磷酸酶是PKA的直接作用底物，PKA通过磷酸化CDC25蛋白的第287位氨基酸，使CDC25磷酸酶失活，不能激活MPF，卵母细胞发生G2期阻滞。受精卵和卵母细胞的发育是两个互相联系但又存在差异的过程，所以对受精卵这一天然的细胞周期模型进行深入研究，将有利于揭示生殖发育的调控机制，进一步认识生长、发育、癌变及死亡机理。小鼠受精卵是脊椎动物中与人类较为接近的细胞周期模型，由于取材有限，关于小鼠受精卵早期发育的机制，尤其是1细胞期向2细胞期的转化，即G2/M期转换机制知之甚少，因此也成为当今国际上研究的热点之一。　　 关于PKA对小鼠CDC25B蛋白的作用，本研究室应用scansite分析软件预测PKA可能磷酸化小鼠CDC25B的321位丝氨酸、229位丝氨酸和149位丝氨酸，并且149位和321位最可能是PKA的生理性作用靶点。作为PKA磷酸化的候选靶位点，我们实验室前期研究证明，在小鼠受精卵1细胞期中，PKA可通过磷酸化小鼠CDC25B的321位丝氨酸(相当于人的323位点)引起小鼠受精卵分裂阻滞。可见，在G2到M期的转换过程中，CDC25B蛋白特定位点的磷酸化可能是对CDC25B细胞内定位及其活性的精确调节方式。值得注意的是，并非磷酸化位点都起作用，我们前期研究还发现，CDC25B蛋白229位丝氨酸的磷酸化对小鼠受精卵发育所起的作用不明显。关于PKA对CDC25B149位丝氨酸磷酸化在小鼠受精卵中的作用尚未证实，在小鼠受精卵发育进程中，PKA是否通过磷酸化CDC25B的149位丝氨酸来调控MPF的活性?还是与321位丝氨酸联合发挥作用，尚需进一步研究证明。　　 然而，在哺乳动物细胞内CDC25B是否为PKA的直接作用底物，CDC25B的磷酸化状态是否与scansite软件预测一致，需要体外磷酸化实验的直接证明。本研究首先采用体外激酶底物磷酸化反应和质谱分析技术证明PKA对小鼠CDC25B的磷酸化靶点，进而探讨PKA的重要靶点149位丝氨酸对小鼠受精卵早期发育及CDC25B在小鼠受精卵中亚细胞定位的影响，同时与S321位点进行对比，分析CDC25B两个磷酸化靶点之间的关系与不同，为揭示PKA/CDC25B通路调控小鼠受精卵早期发育机制提供重要的实验依据。　　 材料与方法：　　 一、材料与试剂中国医科大学实验动物部提供昆明系SPF级雌(4～5周，16～18g)、雄(8周，30～35g)小白鼠[许可证号：SCXK(辽宁)2008-0005]；质粒pBSK-CDC25B由Tony Hunter教授(the Salk Institute)惠赠；质粒pBluescriptⅡ/Sk、pGEX-4T-2和pEGFP-C3由本室保存；质粒pBSK-CDC25B-S149A、pBSK-CDC25B-S321A突变体由本室构建保存；感受态E.coli JM109、DH5α菌株、BL21感受态菌、DNAMarker、Taq酶、IPTG(Takara公司)；mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra kit体外转录试剂盒(Ambion公司)；QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit快速定点突变试剂盒(Stratagene公司)；Glutathione Sepharose4B蛋白层析纯化试剂盒(GE Healthcare公司)；质粒DNA小提取试剂盒(Qiagen公司)；去内毒素质粒中量提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒(Omega公司)；CDC2-pTyr15磷酸化抗体、CDC25B一抗(E-19)、β-Actin抗体、PKA抑制剂H-89(Santa Cruz)；小鼠CDC25B-S149磷酸化抗体和非磷酸化抗体由中国南京川博生物技术有限公司合成；GST单克隆抗体、Western细胞裂解液、Hoechst33258、BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术公司)；HRP标记的兔抗山羊IgG、FITC标记的兔抗山羊IgG、HRP标记的山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)；ECL化学发光试剂盒(Piece Biotechnology公司)；预染蛋白Marker、限制性内切酶XhoⅠ、BamHⅠ、Xba1及Pfu DNAPolymerase(MBI公司)；LB培养基(Invitrogen公司)；PKA、ATP(New England Biolabs)；γ-32P-ATP(比浓度10mCi/ml，北京福瑞生物工程公司)；二丁酰环磷酸腺苷(dbcAMP)、M2和M16培养液、苯甲基磺酰氟(PMSF)(Sigma公司)。　　 二、小鼠截短型CDC25B原核表达载体的构建及融合蛋白的诱导表达与纯化以pBSK-CDC25B野生型为模板，PCR扩增编码CDC25B野生型蛋白从130到330位之间共201个氨基酸的基因片段，长度603bp。将PCR产物和pGEM-4T-2载体分别用XhoⅠ和BamH双酶切后连接、转化、筛选，构建pGEM-4T-2-CDC25B201原核表达载体，阳性克隆送上海生工进行测序验证。将pGEX-4T-2-CDC258201重组质粒按常规方法转化到E.coli BL21感受态细胞中，采用0.1mM IPTG、27℃、诱导表达3h。超声破碎细菌，用Glutathione Sepharose4B蛋白层析柱纯化目的蛋白。取IPTG诱导表达的总蛋白、GST-tag蛋白及纯化目标蛋白，进行10％SDS-PAGE电泳和Western印迹鉴定。　　 三、GST-CDC25B201蛋白的体外磷酸化及放射自显影和质谱分析纯化目标蛋白与γ-32P-ATP、ATP及PKA作用，30℃温育45min，以进行体外磷酸化反应。反应产物进行10％SDS-PAGE电泳、转膜、放射自显影观察磷酸化条带。然后，另取蛋白纯化样品400μg与ATP、PKA体外磷酸化反应，10％SDS-PAGE电泳，根据蛋白marker指示切下目标位置凝胶条带，凝胶样品低温下送至中国科学院生物物理研究所蛋白组研究中心，进行质谱分析。　　 四、小鼠超排卵及受精卵的采集和培养取4～5周昆明系SPF级成熟雌性小白鼠，腹腔内注射PMSG10IU/只，46～48h后腹腔注射hCG10IU/只。当日将注射hCG后的雌鼠与雄性小鼠合笼过夜，次日清晨检查雌鼠阴栓，有阴栓者视为交配成功。将其脱颈椎处死，取输卵管壶腹部，在实体显微镜下撕开壶腹部末端，让受精卵细胞团流出，透明质酸酶除颗粒细胞，用M2培养液洗受精卵，直至卵周围无颗粒细胞。需要培养的受精卵移入M16培养液中，覆盖矿物油，在37℃、5％CO2，饱和湿度CO2培养箱内培养。　　 五、体外突变和CDC25B各种重组质粒的构建以pBSK-CDC25B-S149A为模版，将321位丝氨酸(S)突变成丙氨酸(A)，构建pBSK-CDC25B-S149A/S321A联合突变体；分别以pBSK-CDC25B-S149A、pBSK-CDC25B-S321A和pBSK-CDC25B-S149A/S321A为模版，将149位和321位丙氨酸突变成天冬氨酸(D)，构建pBSK-CDC25B-S149D、pBSK-CDC25B-S-321D和pBSK-CDC25B-S149D/S321D联合突变体。将构建好的pBSK-CDC25B各种质粒和pEGFP-C3载体分别用XhoⅠ和BamHⅠ双酶切，再利用T4 DNA连接酶将CDC25B各种cDNA与pEGFP-C3载体连接，构建成各种pEGFP-CDC25B融合表达载体。上述所有重组质粒送上海生工测序验证。　　 六、体外转录　　 取pBSK-CDC25B-WT及各种突变体质粒1μg，经XbaⅠ酶切线性化后，应用体外转录试剂盒将制备好的线性模板体外转录成带帽mRNA，加入1μl DNaseⅠ，在37℃反应15min以消化DNA模板。用酚、氯仿抽提纯化mRNA，最后加入氯化锂沉淀mRNA，按需要浓度将mRNA溶于TE缓冲液中，用于显微注射。　　 七、显微注射与形态观察显微注射应用Eppendorf Transferman显微操作系统，OlympusX-70倒置显微镜和DIC型相差显微镜观察。取G1或S期受精卵移入到M2培养液中，分别将CDC25B野生型及各种突变体mRNA(10pl)注入胞浆、各种质粒(2pl)注入细胞核中。为了观察PKA对CDC25B及受精卵发育的影响，分别向培养基中加入PKA激活剂dbcAMP或PKA抑制剂H-89，同时再注射各种mRNA或质粒。设置未注射组和TE缓冲液注射组作为对照。所有实验各组均在hCG注射后26～34h之间观察受精卵形态变化、检测MPF活性及CDC2-Tyr15的磷酸化状态。质粒注射组在荧光显微镜下观察受精卵形态及CDC25B的细胞定位情况。　　 八、MPF活性测定收集不同时期的小鼠受精卵，反复冻融3次，使细胞裂解，加入MPF反应液25μl，30℃水浴反应7min。取25μl点在Whatman P81强阳离子交换滤纸上，以75mmol/l磷酸溶液终止反应后，将滤纸置于含10 ml蒸馏水的液闪瓶内，用Beckman液闪计数仪测定cpm值。　　 九、Western印迹实验收集不同时期的小鼠受精卵，4℃离心去除培养液，加入20μl蛋白提取缓冲液，反复冻融裂解，加入SDS样品缓冲液，100℃煮沸5min，10％SDS-PAGE电泳分离，转膜，用含5％脱脂奶粉的TBST(pH7.4)室温封闭1～2h。封闭后的滤膜与CDC25B抗体、CDC2-pTyr15磷酸化抗体、CDC25B-Ser149磷酸化或非磷酸化抗体、GST抗体及β-Actin抗体4℃孵育过夜。HRP偶联的兔抗山羊IgG或羊抗兔IgG作为二抗，室温孵育2h。洗膜后，ECL化学发光法显影成像。　　 十、间接免疫荧光实验将各期受精卵放入4％多聚甲醛溶液固定40min，含0.1％Triton-X100与3％BSA的PBS打孔30min，含3％BSA的PBS室温封闭1～2h。加入CDC25B抗体4℃孵育过夜。次日加入FITC标记的兔抗山羊IgG37℃孵育30min。PBS缓冲液洗涤3遍，加入Hoechest33258荧光染料，室温、避光、3～5min，使核酸着色，在激发光为488nm和260nm的激光共聚焦显微镜下观察CDC25B蛋白在受精卵中的定位及核酸染色情况。　　 实验结果：　　 一、小鼠CDC25B蛋白特定序列的克隆、原核表达与纯化琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增片段长度约600bp，符合预期结果。原核表达载体pGEX-4T-2-CDC25B201经XhoⅠ和BamHⅠ双酶切和上海生工测序鉴定，构建成功。SDS-PAGE电泳显示，pGEX-4T-2-CDC25B201质粒转化组，在约50kD处有明显的GST-CDC25B201融合蛋白条带，与预期大小一致；而pGEX-4T-2空质粒转化组，50kD处没有融合蛋白条带，但在26kD处存在清晰的GST标签蛋白条带。GST-CDC25B201融合蛋白经Glutathione Sepharose4B蛋白层析柱亲和纯化后，SDS-PAGE电泳显示一条与目的蛋白大小相一致的清晰条带。　　 二、GST-CDC25B201融合蛋白的体外磷酸化鉴定结果10％SDS-PAGE和Western blot结果表明GST-CDC25B201蛋白磷酸化条带的位移落后于未磷酸化蛋白。放射自显影显示：GST-CDC25B201磷酸化组和H4阳性对照组在蛋白电泳相应位置有十分明显的磷酸化条带，与预期结果一致；而GST对照组和无激酶的阴性对照组均看不见磷酸化条带。GST-CDC25B201融合蛋白经体外磷酸化后进行LC-MS/MS分析，鉴定到三个磷酸化位点，分别是CDC25B野生型蛋白的149位点、229位点和321位点。　　 三、CDC25B-mRNAs对1-细胞期小鼠受精卵发育的影响显微注射CDC25B-WT-mRNA受精卵在hCG后27.5～28h开始出现卵裂，至31h卵裂率为76.4％，明显高于对照组(约60％)。CDC25B-S149A-mRNA、CDC25B-S321A-mRNA和CDC25B-S149A/S321A-mRNA注射组均在hCG注射后26.5～27h开始出现卵裂，至31h卵裂率分别为90.5％、91.2％、98.3％，S149A/S321A联合突变体注射组卵裂率明显高于S149A和S321A单点突变体注射组卵裂率。而CDC25B-S149D、CDC25B-S321D、CDC25B-S149D/S321D-mRNA注射组的卵裂率与对照组无显著性差别。　　 四、显微注射CDC25B-mRNAs对小鼠受精卵MPF活性和CDC2-Tyr15磷酸化状态的影响CDC25B-WT-mRNA注射组MPF活性在hCG注射后27h明显上升，28h达到高峰；CDC25B-S149A、CDC25B-S321A和CDC25B-S149A/S321A-mRNA注射组则在hCG注射后26.5h急剧上升，27h达到高峰；但CDC25B-S/D三种突变体注射组MPF活性与对照组无显著差异。与此同时，Western印迹表明CDC25B-WT-mRNA注射组在hCG后27.5h检测到微弱的磷酸化信号，证明MPF开始激活；而CDC25B-S149A、CDC25B-S321A和CDC25B-S149A/S321A-mRNA注射组在hCG后27h看不到磷酸化条带，说明MPF已被完全激活；但CDC25B-S149D-mRNA注射组在hCG后28h仍处于磷酸化状态。　　 五、激活PKA显微注射CDC25B-mRNAs对1-细胞期小鼠受精卵发育的影响小鼠受精卵经dbcAMP处理后显微注射CDC25B各种mRNA，结果发现：对照组与CDC25B-S/D三种突变体mRNA注射组受精卵在hCG注射后34h卵裂率几乎为零；CDC25B-WT-mRNA注射组在hCG注射后32h开始卵裂，至34h卵裂率为21.5％，比对照组明显增高；CDC25B-S149A、CDC25B-S321A-mRNA注射组在hCG注射后29.5～30h开始出现卵裂，至34h卵裂率分别为89.5％、90.1％；而CDC25B-S149A/S321A-mRNA注射组在hCG注射后34h卵裂率达到97.8％，明显高于S149A-mRNA和S321A-mRNA单点突变组。　　 六、激活PKA显微注射CDC25B-mRNAs对小鼠受精卵MPF活性和CDC2-Tyr15磷酸化状态的影响对照组MPF活性在hCG注射后29～34h一直处于很低水平，提示PKA激活抑制了MPF活性；CDC25B-WT-mRNA注射组MPF活性在hCG注射后32h升高较明显；CDC25B-S149A-mRNA、CDC25B-S321A-mRNA注射组MPF活性则在hCG注射后29.5h显著上升，30h达到高峰；而CDC25B-S149A/S321A-mRNA注射组MPF活性在hCG注射后29.5h即达到高峰，持续约30min。　　 Western印迹表明：CDC25B-WT-mRNA注射组在hCG注射后32h检测到微弱的磷酸化信号，CDC25B-S149A和CDC25B-S321A-mRNA在hCG后29.5h检测到微弱的磷酸化信号，证明MPF开始激活；而CDC25B-S149A/S321A-mRNA注射组在hCG后29.5h看不到磷酸化信号，说明MPF已被完全激活；但CDC25B-S/D三种突变体mRNA注射组在hCG后34h仍然能检测到清晰的磷酸化信号，说明MPF活性尚未激活，与对照组基本一致。　　 七、抑制PKA显微注射CDC25B-mRNAs对1-细胞期小鼠受精卵发育的影响在H-89存在条件下，对照组与CDC25B-S/D三种突变体mRNA注射组受精卵均在hCG注射后27.5～28h开始出现卵裂，至30h卵裂率均接近80％；CDC25B-WT-mRNA、CDC25B-S149A/S321A-mRNA、CDC25B-S149A-mRNA、CDC25B-S321A-mRNA注射组则在hCG注射后26～26.5h开始出现卵裂，至30h卵裂率达到90％，比对照组显著增高。　　 八、抑制PKA显微注射CDC25B-mRNAs对小鼠受精卵MPF活性和CDC2-Tyr15磷酸化状态的影响受精卵经H-89处理后，对照组和CDC25B-S/D三种突变体注射组MPF活性均在hCG注射27.5h后显著升高，28h达到高峰：CDC25B-WT、CDC25B-S149A、CDC25B-S321A和CDC25B-S149A/S321A-mRNA注射组MPF活性则在hCG注射后26.5h即达到高峰；提示抑制PKA活性可提前激活MPF活性。免疫印迹发现CDC25B-WT、CDC25B-S149A、CDC25B-S321A和CDC25B-S149A/S321A-mRNA注射组在hCG注射后26.5h检测不到磷酸化信号，证明MPF已被激活；而CDC25B-S149D-mRNA注射组在hCG注射后27h仍处于磷酸化状态。　　 九、小鼠受精卵不同细胞周期CDC25B蛋白的表达水平及149位丝氨酸的磷酸化状态G1期细胞CDC25B蛋白表达较少，S期表达开始增加，G2期达到最高水平，M期不再增加，并且在G1和S期蛋白条带位置略高于G2和M期，大约位于70kD，而G2和M蛋白条带位于65kD。同时，在G1和S期检测到磷酸化的CDC25B-Ser149条带位于70kD，而G2期和M期没有检测到任何磷酸化信号，但检测到了非磷酸化的CDC25B-Ser149条带位于65kD，提示CDC25B-S149位丝氨酸在G1和S期被磷酸化，在G2和M期去磷酸化，这与CDC25B抗N-末端抗体检测结果相一致。　　 十、内源性CDC25B蛋白在小鼠受精卵中的亚细胞定位间接免疫荧光实验结果表明：在G1期细胞CDC25B蛋白偶联的绿色荧光信号主要弥散于细胞浆，且以接近细胞膜的皮质部分更明显；S期绿色荧光信号则分布于整个细胞；但在G2期核区部位的绿色荧光信号明显强于细胞质；在M末期到2-细胞期可见绿色荧光信号又重新分布于细胞浆，核区荧光减弱。提示：1-细胞期受精卵从G2向M期的转换过程中，发生了CDC25B向细胞核的转位，到2-细胞初期，部分CDC25B蛋白又从细胞核回到细胞浆。　　 十一、外源性CDC25B蛋白在小鼠受精卵中的表达和定位pEGFP-CDC25B-WT显微注射后约7h(hCG后27h)，pEGFP-CDC25B-S/A三种突变体显微注射后约6h(hCG注射后26h)，受精卵进入S后期，此时荧光信号弥散于整个细胞；但在G2期细胞观察到，核区部位的绿色荧光信号明显强于细胞质；至M末期和小鼠受精卵2-细胞期，荧光信号明显减弱并主要分布于细胞质。pEGFP-C3空质粒注射组绿色荧光信号出现时间比pEGFP-CDC25B-WT注射组延迟约1h，并且在细胞周期各个时期绿色荧光信号强度均匀分布于整个受精卵中。pEGFP-CDC25B-S/D三种突变体注射组绿色荧光信号出现时间与pEGFP-C3空质粒注射组基本一致，但在整个细胞周期中绿色荧光信号较弥散或主要分布于细胞质。　　 讨论：PKA广泛参与调节多种真核细胞的细胞周期进程，一些研究提示，CDC25B可能是PKA的作用底物，但目前为止尚缺乏体外磷酸化的直接证明，特别是关于哺乳动物PKA对CDC25B的具体作用靶点尚需进一步研究证实。　　 为了解决这一问题，本研究首先构建小鼠CDC25B野生型蛋白特定序列(130到330位之间共201个氨基酸)的pGEX-4T-2-CDC25B原核融合表达载体，进而在E.coli BL21细胞内经IPTG诱导表达，纯化蛋白再通过PKA体外磷酸化反应和质谱分析技术鉴定PKA对小鼠CDC25B的磷酸化靶点。结果表明：CDC25B蛋白特定序列在体外可被PKA磷酸化，LC-MS/MS分析鉴定到三个磷酸化位点，分别是CDC25B野生型蛋白的S149、S229和S321位点，与scansite软件预测结果一致，因此证明在哺乳动物CDC25B是PKA的直接作用底物。　　 但是关于细胞内PKA对CDC25B的三个磷酸化位点在细胞周期中的调节作用尚需进一步研究探讨。目前人们比较公认的是S321位点磷酸化在卵母细胞G2期阻滞和受精卵有丝分裂阻滞中的作用，本研究进一步探讨CDC25B149位丝氨酸磷酸化对小鼠受精卵发育的影响。结果发现在小鼠受精卵1细胞期内过表达CDC25B-WT和CDC25B-S149A、CDC25B-S321A及CDC25B-S149A/S321A三种突变体，可有效促进受精卵有丝分裂进程，提高卵裂率；并且三种突变体的作用明显强于野生型CDC25B，但CDC25B-S149A/S321A联合突变体的作用强于CDC25B-S149A和CDC25B-S321A，提示CDC25B蛋白S149位点可能是PKA调控CDC25B进而影响小鼠受精卵发育的另一个重要靶点，并且与S321位点可能存在协同作用。　　 为了证明在细胞内PKA是否通过磷酸化CDC25B的S149位点调控受精卵的发育，我们分别将小鼠受精卵放在含有PKA激活剂dbcAMP和PKA抑制剂H-89的M16培养液中进行培养，1h后显微注射CDC25B-WT-mRNA和CDC25B各种突变体mRNA，结果发现在2mmol/l dbcAMP存在时，小鼠受精卵过表达突变体CDC25B-S149A、CDC25B-S321A和CDC25B-S149A/S321A可以逆转dbcAMP诱导的小鼠受精卵卵裂阻滞，但过表达CDC25B-WT则不能有效逆转dbcAMP诱导的G2/M期阻滞。相反，在40μmol/l H-89存在时，细胞内PKA活性被完全抑制，所以小鼠受精卵过表达CDC25B-WT的作用和过表达突变体CDC25B-S149A、CDC25B-S321A及CDC25B-S149A/S321A的作用一样，都能显著加速受精卵有丝分裂进程，且四组间无明显差异。上述实验结果间接证明CDC25B蛋白S149和S321位点都是PKA调控CDC25B的重要磷酸化靶点。　　 许多研究表明，CDC25B磷酸酶在G2/M期转换过程中可使CDC2激酶去磷酸化，肩负激活MPF的重大责任，是早期有丝分裂的启动因子，同时也是卵母细胞恢复减数分裂的核心调控因子。本研究室前期研究充分证明PKA通过磷酸化CDC25B-S321位点丝氨酸对MPF活性起负性调节作用。本研究在此基础上进一步阐明CDC25B-S149位点丝氨酸磷酸化对MPF活性的调节作用与S321位点没有显著区别，但过表达三种突变体CDC25B-S149A、CDC25B-S321A和CDC25B-S149A/S321A的小鼠受精卵MPF活性基本不受dbcAMP的影响，并且过表达CDC25B-S149A/S321A小鼠受精卵MPF活性比过表达CDC25B-S149A和CDC25B-S321A实验组提前30min达到高峰，提示CDC25B-S149A/S321A的作用强于CDC25B-S149A和CDC25B-S321A，S149位点与S321位点存在协同作用。与此同时，我们还观察到实验各组MPF活性的变化与其催化亚基CDC2-Tyr15的磷酸化状态完全一致，说明CDC25B对MPF活性的影响是通过调节CDC2-Tyr15的磷酸化状态来实现的。然而，小鼠受精卵内过表达模拟磷酸化突变体CDC25B-S149D、CDC25B-S321D和CDC25B-S149D/S321D对MPF活性和CDC2-Tyr15的磷酸化状态都没有影响，其变化趋势与对照组完全一致。　　 为了进一步证明内源性CDC25B蛋白S149位点的磷酸化状态与其调控细胞有丝分裂进程有关，本研究分别收集小鼠受精卵1-细胞期的G1、S、G2、M期细胞，应用特异的CDC25B-pS149位的磷酸化抗体检测各时期CDC5B-S149位的磷酸化状态，应用CDC25B-S149位的非磷酸化抗体检测各时期CDC5B-S149位的非磷酸化状态。结果表明：在G1和S期检测到清晰的磷酸化CDC25B条带，而G2期和M期没有检测到任何磷酸化信号，但检测到了非磷酸化的CDC25B条带，说明CDC25B-S149位丝氨酸在G1和S期被磷酸化，在G2和M期去磷酸化。这一现象与我们前期报道的CDC25B-S321位丝氨酸在小鼠受精卵1细胞期中的变化趋势相一致。上述实验结果进一步证明CDC25B蛋白S149位点与S321位点一样，都是PKA调控CDC25B的重要磷酸化靶点。　　 许多研究表明CDC25B蛋白活性的调节除了蛋白水平和磷酸化修饰的调节之外，亚细胞定位也是重要的调节方式之一，CDC25B的核输出与核定位对于其有效的促发有丝分裂是必须的。本研究初步探讨了CDC25B细胞内定位对1细胞期小鼠受精卵发育的影响。间接免疫荧光实验发现，在G1期细胞CDC25B蛋白偶联的绿色荧光信号主要弥散于细胞质，S期绿色荧光信号则分布于整个细胞，但在G2期核区部位的绿色荧光信号明显强于细胞质，在M末期到2-细胞期可见绿色荧光信号又重新分布于细胞浆，核区荧光减弱。与此同时，我们构建了pEGFP与CDC25B的融合表达质粒，并于G1期注射到小鼠受精卵细胞核内，进一步观察外源性CDC25B的表达和定位。结果表明，受精卵进入S后期，绿色荧光信号弥散于整个细胞；但在G2期细胞观察到核区部位的绿色荧光信号明显强于细胞质；至M末期和2-细胞期，荧光信号明显减弱并主要分布于细胞质。上述细胞周期中荧光信号强度的变化提示：在细胞周期转换中可能伴随有CDC25B的核浆转位，CDC25B在细胞内的定位信息可能与其磷酸化修饰有关。根据上述实验结果我们推测：受精卵在G1和S期，CDC25B在细胞质与细胞核区都有表达定位，但以细胞质为主，此时CDC25B蛋白受PKA作用，S149和S321位点主要以磷酸化形式存在；当受精卵发育到G2期时，磷酸化的CDC25B被某种蛋白磷酸酶去磷酸化后激活，并从细胞质向核区转移，从而激活MPF触发有丝分裂；至M末期完成使命的CDC25B可能又从细胞核转移到细胞质或发生降解。　　 总之，本研究首次通过体外磷酸化反应和质谱分析技术证明PKA对小鼠CDC25B蛋白调控的磷酸化位点，进一步阐明CDC25B-S149位点是PKA/CDC25B通路调控小鼠受精卵早期发育的重要磷酸化靶点，并且与S321位点可能存在协同作用。本研究通过体内外实验均证明，在哺乳动物CDC25B是PKA的直接磷酸化底物。本研究不仅为揭示小鼠受精卵早期发育机制奠定了坚实的基础，而且为阐明其它哺乳动物细胞PKA/CDC25B通路调节细胞有丝分裂的具体机制提供了新的线索和有价值的实验依据。　　 结论　　 1、采用体外激酶底物磷酸化实验和质谱分析技术证明小鼠CDC25B是PKA的直接磷酸化底物，其磷酸化位点包括第149、229和321位丝氨酸。　　 2、PKA/CDC25B通路对小鼠受精卵早期发育具有重要的调控作用。在小鼠体内，PKA通过对CDC25B蛋白S149和S321位点进行磷酸化修饰影响其细胞内定位，抑制MPF活性，从而引起受精卵分裂阻滞；并且S149与S321位点可能存在协同作用。　　 3、在细胞周期的不同时期，CDC25B蛋白存在核浆移位，CDC25B在细胞内的这种定位变化与其磷酸化修饰和调控小鼠受精卵有丝分裂有关。